目的探讨人CRIF1基因对骨髓间充质干细胞(hBMSCs)细胞周期调控机制。方法通过构建慢病毒载体改变CRIF1表达水平,合成发夹shRNA模板寡核苷酸链,构建pGreenPuro-sh-CRIF1干扰载体;PCR扩增CRIF1基因CDS全长,链接pMD18-T载体经测序鉴定后,构建pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP过表达载体。载体成功构建后包装慢病毒,并转染hBMSCs,以pLentis-CMV-SFFV-GTP空载体病毒作为对照,定量PCR及Western blot(WB)检测CRIF1基因和蛋白表达,流式细胞仪检测hBMSCs细胞周期分布,并通过免疫荧光观察CRIF1与CDK2细胞共定位。结果成功构建CRIF1 shRNA及过表达慢病毒载体,测定后病毒滴度达到108TU/mL。以MOI=10转染hBMSCs,并以0.8μg/mL嘌呤霉素筛选1周后,感染效率可达到>95%,WB及定量PCR证实,CRIF1基因和蛋白的表达水平,在pGreenPuro-sh-CRIF1载体转染后hBMSCs细胞受到抑制:与对照组比较,mRNA相对表达水平0.42±0.03 vs1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平0.13±0.024 vs 1.00±0.04(P<0.01),而pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP载体转染后得到增强:与对照组比较,mRNA相对表达水平5.54±0.53 vs 1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平4.21±0.22 vs 1.00±0.04(P<0.01)。同时,CRIF1基因过表达诱导hBMSCs G0/G1期阻滞(与对照组比较,84.99±2.66 vs 77.28±0.86,P<0.01),抑制CRIF1基因表达促进其进入细胞周期循环:G0/G1期比例与对照组比较,61.60±3.02 vs 77.28±0.86(P<0.01)。激光共聚焦显示,CRIF1与CDK2共定位于胞浆与胞核。结论 CRIF1可能通过与CDK2结合,负性调控hBMSCs细胞周期分布。
