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重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究被引量：2: 2014年; 目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过PCR的方法获得eh的c DNA,PCR产物连接入原核表达载体p ET-22或p ET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(ply Ss),获得重组工程菌BL21(DE3)-p ET-24-eh,BL21(DE3)-p ET-22-eh,BL21(ply Ss)-p ET-22-eh。重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为BL21(DE3)-p ET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4μmol/L,诱导前菌种密度在OD600=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。; 张超巩蔚郭莹莹孙卫国姚敏于爱平; 关键词：原核表达可溶性表达抗凝

荧光定量PCR检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组DNA的残留量被引量：5: 2014年; 目的：建立real—timePCR定量检测毕赤酵母基因组DNA残留量的方法，提高重组新蛭素的产品安全性。方法：选择拷贝数高且分布广泛的毕赤酵母5SrRNA基因为靶标基因设计扩增引物，提取酵母基因组DNA，稀释后作为扩增模板。以罗氏荧光定量PCR_Light Cycler 480平台为基础，建立基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的real—timePCR的检测方法，并考察用该方法检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组残留量的灵敏度、精密度和回收率。结果：该法检测宿主DNA残留量灵敏度高，DNA浓度为0．1～1000pg／μL范围内呈现良好的线性关系，其标准曲线的误差值小于0．2；用该法对5批注射用重组新蛭素（酵母）产品中宿主基因组DNA残留量进行了测定，结果分别为0．03、2.3、0.2、0．6、0．2μg／mg。结论：该方法具有操作简便、灵敏度高等优点，可用于重组产品中酵母基因组残留DNA的定量测定。; 刘晶晶郭莹莹李艳琪王文文吴祖泽靳继德; 关键词：荧光定量PCR 毕赤酵母

大肠杆菌表达的重组新蛭素的生产工艺: 2016年; 为建立可产业化的大肠杆菌表达的重组新蛭素(neorudin,EH)生产工艺,主要采取从低密度到高密度发酵的优化思路,优化了发酵罐培养基和诱导时间;比较了超声破碎和反复冻融的目的蛋白提取方法;纯化工艺采用离子交换层析2步法进行:SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Source 15Q阴离子交换层析;所得产品用免疫印迹法鉴定,经HPLC检测纯度,凝块法检测抗凝比活性;最后对纯化产品进行结构确证,包括高分辨率质谱、C-末端测序、N-末端测序、二硫键分析.结果显示:优化后的发酵工艺确定基于TB培养基的高密度发酵工艺,菌体OD_(600)可达40左右,每升菌体湿质量可达70 g左右,目的蛋白表达量约400 mg/L;菌体反复冻融离心上清经过纯化获得的目的蛋白HPLC纯度均大于97%,纯化收率为26.12%,抗凝比活性为1 024 ATU/mg,用高分辨率质谱检测其分子质量约为7 415.188 0 ku,N-末端、C-末端和二硫键均与理论相符.建立了EH在大肠杆菌中的高密度发酵和纯化工艺.; 吴祖泽郭莹莹刘玉斌郭彦梅董俏言靳继德姚敏于爱平; 关键词：大肠杆菌高密度发酵离子交换层析抗凝活性

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郭莹莹

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