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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定: 2015年; 本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSVORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDSPAGE和Western blotting分析,在约22ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。; 周玉照马志亮孙亭亭杨洁张小苗柴俊张娜娜张以芳; 关键词：ORF5基因大肠杆菌乳酸乳球菌

荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法: 本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。该方法包括猪蓝耳病病弱毒疫苗病毒特异性引物设计、RNA提取、cDNA制备、实时荧光定量RT-PCR扩增、标准质粒构建及检测标准...; 张以芳范斌马志亮刘旭川邹丰才柴俊刘岳柳桐; 文献传递

奶牛结核病候选基因CARD15基因及功能突变检测方法: 本发明属于分子生物学动物疾病诊断技术领域，具体涉及一种奶牛结核病候选基因CARD15基因及其功能突变检测方法。本发明提供的奶牛结核病候选基因CARD15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的奶牛结核...; 张以芳柳桐史宪伟王生奎柴俊马志亮孙亭亭秦波王有涛; 文献传递

红色原鸡外周血单个核细胞IFN-γ的诱导表达及其荧光定量PCR检测: 2014年; 为建立检测红色原鸡外周血单个核细胞(PBMC)中干扰素γ(IFN-γ)mRNA表达水平的方法,通过优化刀豆蛋白A(Con A)诱导PBMC表达IFN-γ的条件,采用RT-PCR方法以3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参扩增IFN-γ基因,插入克隆载体pMD18-T分别构建重组质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH,以其作为标准品采用SYBR Green I染料法建立荧光定量PCR检测方法,并将该方法应用于34只红色原鸡PBMC IFN-γ表达量的检测。结果发现,PBMC在20μg/mL Con A刺激培养12-25 h时IFN-γ处于高表达水平;标准品质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH分别在拷贝数6.72×102-6.72×109、3.94×102-3.94×109范围内与其对应的Ct值呈现良好的线性关系(R2>0.99),扩增产物的熔解曲线均只有特异的单峰,表明所用引物特异性强。在优化Con A诱导红色原鸡PBMC表达IFN-γ条件的基础上,建立了可用于定量检测红色原鸡PBMC IFN-γmRNA表达水平的荧光定量PCR方法。; 孙亭亭冀斌马志亮胡文丽鲁琼芬张雄伟陈培富; 关键词：CON 荧光定量PCR 外周血单个核细胞

荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法: 本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。该方法包括猪蓝耳病病弱毒疫苗病毒特异性引物设计、RNA提取、cDNA制备、实时荧光定量RT-PCR扩增、标准质粒构建及检测标准...; 张以芳范斌马志亮刘旭川邹丰才柴俊刘岳柳桐; 文献传递

一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法: 本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 属疫苗质量监测技术领域。本发明方法包括特异性引物及Taqman荧光探针的设计、RNA提取、cDNA制备、标准质粒构建、Taqman荧光定量PCR检测...; 张以芳马志亮范斌柴俊孙亭亭邹丰才刘岳柳桐杨洁; 文献传递

一种猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌的构建、表达方法: 本发明提供了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组乳酸菌的方法，包括：1、猪瘟病毒F114毒株E2基因的克隆与序列分析；2、猪瘟病毒重组表达载体PNZ44‑E2的构建；3、重组质粒PNZ44‑E2在干酪乳酸杆菌中的电转化及表达；...; 张以芳童亮张绍美杨洁马志亮周玉照张辰宇徐佳柴俊刘旭川; 文献传递

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用被引量：5: 2014年; 为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5′非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法检测的敏感度达1.20×105拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%~0.39%,批间变异系数为0.32%~0.61%。应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异。结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量。; 范斌许文花韩建强马志亮胡骑信爱国张以芳; 关键词：猪瘟兔化弱毒实时荧光定量RT-PCR 病毒含量

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建与表达: 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建与表达，属于生物技术领域，其特征是：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因克隆、测序，对重组质粒pMD19(simple)‑dGP5和载体pNZ8149均以Nco Ⅰ、Xb...; 张以芳马志亮杨洁周玉照张辰宇郑锦玲刘旭川; 文献传递

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗中病毒含量荧光定量PCR测定方法的建立及初步应用被引量：4: 2014年; 为建立快速、敏感、特异的评价猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）活疫苗中病毒含量的方法，根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因序列设计合成了标准品引物和定量引物，RT—PCR扩增PRRSV基因片段并连接到pMD19-T载体上，构建标准品质粒pMD19-TPRRSV。采用SYBRGreenI染料法进行荧光定量PCR检测，分析标准曲线并进行特异性、稳定性、重复性试验。结果显示，该方法检测病毒含量为7．43×10^0～7．43×10^8拷贝／μL，标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数高（R2=0．9989），引物特异性强。应用该方法对6个厂家PRRS活疫苗中的病毒含量进行测定，发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量差异较大，最高差异可达47．9倍。本试验建立的检测PRRS活疫苗病毒含量的荧光定量PCR方法可用于疫苗生产过程中及免疫动物前疫苗质量的评价。; 马志亮孙亭亭杨洁范斌刘旭川张以芳; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征活疫苗荧光定量PCR

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马志亮