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缺氧对HRE-TK/GCV系统杀伤骨肉瘤细胞的增强作用被引量：2: 2005年; 目的:探讨缺氧条件下,缺氧反应元件启动子-胸苷激酶/丙氧鸟苷(HRE-TK/GCV)系统对骨肉瘤细胞系MG63靶向性杀伤作用。方法:构建由HRE启动子驱动的含潮霉素磷酸转移酶-单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Hygromycinphosphotransferase-thymidinekinase,HyTK)融合基因的真核表达质粒pBI-HRE-HyTK,并将其转染入骨肉瘤细胞系MG63。应用PCR和RT-PCR方法检测TK基因的整合及表达;用MTT法和混合共培养实验分别检测转基因细胞在缺氧或不缺氧状态下对GCV的敏感性以及HRE-TK/GCV系统的“旁观者效应”;流式细胞仪检测细胞周期改变及电镜观察细胞超微结构变化探讨其作用机制。结果:成功构建了真核表达质粒pBI-HRE-HyTK,得到转基因细胞系MG63TK。检测到MG63TK细胞内TK基因的DNA和mRNA。MG63TK细胞在不缺氧状态下对GCV不敏感,当GCV浓度达50μg/ml时,仅30%左右细胞被杀死;而缺氧状态下,GCV浓度1μg/ml时,50%左右细胞被杀死,GCV浓度50μg/ml时,90%以上细胞被杀死。混合共培养实验中,缺氧状态下,HRE-TK/GCV系统旁观者效应明显增强,MG63细胞存活率显著低于不缺氧状态下。缺氧和GCV共同作用使转基因细胞DNA合成抑制,细胞周期阻滞于G0G1期,细胞发生凋亡和坏死。结论:缺氧可以增强HRE-TK/GCV系统对体外培养骨肉瘤细胞系选择性的杀伤作用?; 王燕丘钜世乔慧汪睿彭挺生李扬EG Van Meir; 关键词：缺氧缺氧反应元件胸苷激酶骨肉瘤细胞

N端截短的视网膜母细胞瘤基因对人骨肉瘤细胞株SaOS-2生长的影响被引量：2: 2004年; 目的研究N端截短的视网膜母细胞瘤基因(Rb^(66))对骨肉瘤细胞Saos-2生长的影响。方法构建携带Rb^(66)cDNA片段的真核细胞表达载体pcDNA3-1-Rb,用脂质体LIPOFECTAMIME^(TM)2000将真核表达载体pcDNA3-1-Rb、空载体对照pcDNA3-1转染至SaOS-2细胞中。RT-PCR及免疫细胞化学检测转染后SaOS-2中Rb^(66)mRNA及蛋白的表达;观察细胞形态的改变;测定细胞倍增时间及生长曲线的改变;流式细胞仪检测对细胞周期的影响。结果成功地将N端截短的Rb^(66)cDNA导入骨肉瘤细胞SaOS-2中,并在mRNA及蛋白水平获得了表达。转染后的SaOS-2细胞胞浆展开,细胞核浆比例变小;Rb^(66)导入后,SaOS-2细胞生长减慢,群体倍增时间延长,细胞周期呈现G_1期阻滞。结论 Rb^(66)可通过阻止细胞G_1→S期进展而抑制骨肉瘤细胞SaOS-2的增殖。; 李扬乔慧邓家德张萌朱全胜丘钜世; 关键词：视网膜骨肉瘤细胞株细胞周期

全反式维甲酸对骨肉瘤细胞OS732生长的影响被引量：6: 2005年; 目的观察全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)对骨肉瘤细胞OS732生长的影响,并探讨其作用的分子机制。方法用10-5MATRA作用骨肉瘤细胞OS732,6d后,进行细胞形态学观察、活细胞计数、流式细胞仪分析细胞周期、半定量RT-PCR检测细胞周期调控蛋白CyclinD(D1、D2、D3)、CDK4、P21WAF1mRNA表达的改变。结果ATRA作用后,OS732细胞胞浆展开,细胞核变小,核浆比例变小;瘤细胞生长减慢,细胞计数为正常对照组的39.5%;G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少,细胞阻滞于G0/G1期;CyclinD1、CyclinD2、CDK4mRNA表达均下降,尤以CyclinD2、CDK4下降最明显,CyclinD3、P21WAF1mRNA未见明显改变。结论10-5M全反式维甲酸可明显抑制骨肉瘤细胞OS732的增殖,并使细胞周期出现G1/G0期阻滞,该作用可能与维甲酸处理后OS732细胞中CyclinD2、CDK4表达的下调以致低磷酸化pRb积累有关。; 李扬丘钜世邓家德张萌乔慧; 关键词：维甲酸骨肉瘤细胞周期

缺氧反应元件启动子表达反义血管内皮生长因子(VEGF)_(165)cDNA靶向性抑制骨肉瘤细胞VEGF表达被引量：8: 2005年; 目的以缺氧诱导因子1/缺氧反应元件(HIF1/HRE)基因调节系统为载体,构建含HRE启动子的人反义血管内皮生长因子(VEGF)165cDNA真核表达载体,探讨其对缺氧条件下骨肉瘤细胞VEGF表达的靶向性抑制作用。方法采用聚合酶链反应(PCR)和DNA重组技术构建由HRE启动子驱动的含荧光素酶(Luc)报告基因和人反义VEGF165cDNA全长的真核表达质粒,将其转染骨肉瘤细胞系MG63,用液闪计数仪测定缺氧对报告基因表达的调节,酶链免疫吸附试验(ELISA)法检测缺氧条件下细胞VEGF表达的变化。结果成功构建了由HRE启动子驱动的含Luc和反义VEGF165cDNA全长的真核表达质粒pBIHRELucAsVEGF165,该质粒转染骨肉瘤细胞系,缺氧条件下可使报告基因在肿瘤细胞中的表达提高3.5×102倍,使肿瘤细胞VEGF分泌下降45%。结论利用肿瘤缺氧,HRE启动子能够实现反义VEGF165的高效表达,为开展靶向性抗肿瘤血管生成治疗提供了实验依据。; 王燕汪睿乔慧李晋云彭挺生李扬张萌梁惠珍丘钜世; 关键词：骨肉瘤内皮生长因子反义血管内皮生长因子骨肉瘤细胞系缺氧反应元件 VEGF表达启动子

视网膜母细胞瘤基因对人骨肉瘤细胞株OS732的影响: 2002年; 目的　观察外源性N端截短的视网膜母细胞瘤 (Rb)基因对骨肉瘤细胞株OS732的生长和细胞间缝隙连接信息通讯能力的影响。方法　构建N端截短的长度为 1 6 5kbRb基因的真核表达质粒 ,并用DOTAP将其导入骨肉瘤细胞株OS732。应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)和Northernblot检测Rb基因的表达 ;用细胞计数、流式细胞仪分析和软琼脂克隆形成试验观察OS732细胞的生长状况 ;用半定量RT PCR法和罗氏黄荧光传输法检测细胞间缝隙连接信息通讯的能力。结果　转染N端截短的Rb基因后 ,OS732细胞内可检测到内源性和外源性Rb基因的mRNA表达 ;OS732细胞的形态发生改变 ,其生长速度减慢 ,软琼脂形成集落能力降低 ,细胞周期阻滞于G0 G1期 ;缝隙连接蛋白基因Connexin4 3的表达和细胞间信息通讯能力增强。; 乔慧丘钜世李扬张萌; 关键词：基因视网膜母细胞瘤骨肉瘤转染

膜型/可溶型MHCⅠ类链相关分子A及其受体NKG2D在骨肉瘤中的表达及其意义被引量：4: 2007年; 目的探讨膜型/可溶型 MHC Ⅰ类链相关分子 A(MICA)及其受体 NKG2D 在骨肉瘤中的表达及其意义。方法采用免疫组织化学(LSAB法)检测膜型 MICA(mMICA)在43例骨肉瘤组织中的表达;用流式细胞仪检测上述病例中的16例患者外周血淋巴细胞 NKG2D 的表达;用 ELISA 法检测患者血清中可溶型 MICA(sMICA)的水平。结果骨肉瘤细胞广泛表达 mMICA(37/43),外周血淋巴细胞 NKG2D 的表达普遍下降,两者的表达水平均与骨肉瘤的分化呈正相关(P<0.05),与临床分期呈负相关(P<0.05)。检测16例骨肉瘤患者血清中 sMICA 含量,其中5例升高,且与骨肉瘤的远处转移及临床分期呈正相关(P<0.05)。结论 (1)骨肉瘤细胞表达 mMICA,外周血淋巴细胞NKG2D 的表达以及血清中 sMICA 的含量与骨肉瘤的分化及临床分期相关,因此可望作为骨肉瘤病理诊断和估计预后的生物学指标。(2)MICA-NKG2D 介导的免疫监视障碍可能促进了骨肉瘤的进展。; 肖萍薛玲车丽洪吴惠茜乔慧; 关键词：骨肉瘤 MHC

NKG2D及其配体在肿瘤免疫中的作用被引量：2: 2005年; 肖萍薛玲乔慧; 关键词：NKG2D NKG2D配体肿瘤免疫

骨肉瘤组织中MICA、MMP-9和NF-κB蛋白的表达及相关性被引量：5: 2009年; 目的探讨骨肉瘤组织中MHCⅠ类链相关蛋白A(MHC class Ⅰ chain-related A,MICA)、MMP-9和NF-κB的表达及相互间的关系,为研究骨肉瘤组织中MICA蛋白表达和脱落机制提供组织学依据。方法应用免疫组织化学方法检测66例骨肉瘤、11例骨母细胞瘤,8例骨化性纤维瘤和6例正常骨组织中MICA蛋白的表达情况,并检测66例骨肉瘤组织中MMP-9和NF-κB蛋白的表达情况。结果(1)MICA蛋白在骨肉瘤组织、骨母细胞瘤、骨化性纤维瘤和正常骨组织的表达率分别为51.6%(34/66)、9%(1/11)、0(0/8)、0(0/6),骨肉瘤组织中MICA表达与骨母细胞瘤(P=0.01)、骨化性纤维瘤(P<0.01)和正常骨组织(P<0.05的差异有显著性。(2)骨肉瘤组织中MMP-9和NF-κB表达率分别为55%(36/66)和73%(48/66);NF-κB与MICA(r=0.373,P<0.01)和MMP-9(r=0.536,P<0.01)的表达呈正相关关系。结论MICA蛋白可作为骨肉瘤诊断的分子标志物;NF-κB可能参与MICA蛋白表达和脱落的分子机制,NF-κB可作为骨肉瘤免疫治疗的候选靶点。; 卢善明薛玲肖萍李扬曹清华乔慧; 关键词：骨肉瘤 MICA MMP-9 NF-ΚB

联合应用自杀基因/前药系统和放疗对人骨肉瘤细胞的杀伤作用被引量：5: 2002年; 目的观察联合应用自杀基因/前药系统和放疗对人骨肉瘤细胞的杀伤作用。方法以大肠杆菌JM107为模板,PCR扩增出CD基因,测序并将其插入真核表达质粒pEGFP-C1中,构建EGFPCD融合基因。用DOTAP将分别含有CD和HSV-TK的两种质粒pEGFP-CD和tgCMVHyTK同时导入人骨肉瘤细胞SAOS-2,经G418和潮霉素B共同筛选后,于荧光显微镜下观察阳性克隆细胞株SAOS-2CDTK。运用PCR和Northernblot方法检测SAOS-2CDTK细胞中的CD和HSV-TK基因及其表达。用MTT法检测单独或联合应用两种前药(GCV、5-FC)对SAOS-2CDTK细胞的存活率、“旁观者效应”以及细胞对放疗敏感性的影响。结果测序图和酶切鉴定证明CD基因的克隆和含EGFPCD融合基因的重组真核表达质粒pEGFP-CD的构建是成功的。荧光显微镜观察SAOS-2CDTK细胞胞质呈现绿色荧光。PCR和Northernblot分析均表明SAOS-2CDTK细胞中含有CD和HSV-TK两个基因,并获得mRNA水平的表达。与单一前药相比,联合应用两种前药时,SAOS-2CDTK细胞的存活率下降,“旁观者效应”及细胞对放疗的敏感性增强。结论联合应用两种自杀基因/前药系统和放疗可增强细胞毒作用,为骨肉瘤的治疗提供了一条新的有效途径。; 乔慧丘钜世朱全胜王晋; 关键词：骨肉瘤基因疗法胞嘧啶胸苷激酶

骨肉瘤组织中MICA基因mRNA和蛋白的表达被引量：2: 2009年; 【目的】检测骨肉瘤组织中MHCI类链相关蛋白A(MHC class I chain-related A,MICA)基因mRNA和蛋白的表达情况,为探讨骨肉瘤的肿瘤免疫机制提供信息。【方法】应用RT-PCR方法检测MICA mRNA在11例新鲜骨肉瘤组织和5个骨肉瘤细胞株中的表达情况;分别应用免疫组织化学方法、Western blot和流式细胞术检测66例石蜡包埋骨肉瘤组织、6例石蜡包埋正常人骨组织、9例新鲜骨肉瘤组织和5个骨肉瘤细胞株中MICA蛋白的表达情况。【结果】骨肉瘤组织中MICA mRNA表达率为81.8%(9/11),5个骨肉瘤细胞株均表达MICA mRNA;MICA蛋白在骨肉瘤组织和正常骨组织的表达率分别为51.6%(34/66)和0%(0/6);骨肉瘤细胞株Saos-2、MG63和HOS阳性表达膜表面MICA蛋白,而细胞株U2OS和OS732只有少量细胞呈阳性表达。【结论】MICA mRNA和蛋白广泛表达于骨肉瘤组织和细胞株。; 卢善明薛玲肖萍李扬车丽洪乔慧; 关键词：骨肉瘤 MHC MICA

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乔慧

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