李芳菲
- 作品数：22 被引量：61H指数：5
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：教育部科学技术研究重点项目重庆市自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- 人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染被引量：3
- 2007年
- 目的:构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.方法:以重组质粒pcDNA3.1/lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-Nl中,形成重组表达载体pEGFP-Nl/lif,并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT-PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP-LIF.结论重组pEGFP-N1/lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白,为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.
- 林雪梅李芳菲姜蓉王莎莉王亚平
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白人胚肺成纤维细胞
- 利用显微数码互动系统,探索组织胚胎学实验互动教学法的实施被引量：18
- 2005年
- 分析了显微数码互动系统是组胚实验教学的又一现代化教学手段,其技术特性非常适合互动教学法等新型教学法的实施,并就其具体运用进行了初步探讨.
- 林雪梅李芳菲
- 关键词：教学法组织胚胎学现代化教学手段
- 以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较被引量：7
- 2006年
- 目的：比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞（hELF）作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞（EG）生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化．方法：分离、培养3—4mohELF，观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化，以STO细胞和hELF作为饲养层培养人EG细胞，计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）和抗阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA-4）．结果：经丝裂霉素c处理后hELF较STO细胞生存时间明显长，形态维持更好；以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞，集落形成率没有明显差异；两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异．结论：在培养人EG细胞时，hELF饲养层较STO细胞饲养层更有优势．
- 刘永刚李芳菲陈地龙王莎莉王亚平
- 关键词：胚胎生殖细胞
- 人胚胎生殖细胞定向造血细胞诱导分化的初探
- ＜正＞目的本研究自行分离、培养的胚胎生殖细胞,联合应用多种细胞因子,在体外通过二步法诱导人EG细胞定向诱导分化为造血细胞,旨在为胚胎干细胞的基础研究和临床应用研究奠定基础。方法从流产胚胎中分离、培养人胚胎生殖细胞（EG细...
- 李芳菲刘永刚王亚平
- 文献传递
- 胚龄及分离方法对小鼠胚胎生殖细胞扩增效率的影响
- 2008年
- 目的：应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物。但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈。实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台。方法：实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成。①实验材料：清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取胚龄8．5d胎鼠尾端尿囊及周围组织，取胚龄9．5～10．5d胎鼠后肠及周围组织，取胚龄11．5d，12．5d胎鼠生殖嵴及周围组织，分别经0．25％胰酶一0．02％EDTA消化并接种于0．1％明胶包被的培养皿中。比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响。采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率，计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11．5d，12．5d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力。比较上述两种取材培养方法对胚龄11．5d，12．5d原始生殖细胞扩增的影响。采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA一1、免疫荧光检测Nanog，体外分化实验鉴定分化能力。结果：①胚龄11．5d，12．5d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8．5～10．5d高，扩增效率显著提高（P〈0．01）。②免疫组织化学法检测分离的胚龄11．5d，12．5d原始生殖细胞SSEA-1阳性率差异不显著（P〉0．05）。原代第3天克隆计数显示，胚龄11．5d胎鼠高于12．5胚龄胎鼠（P〈0．01），MTT数据显示11．5胚龄组稍高于12．5胚龄组。③两种方法对胚龄11．5d，12．5d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异（P〉O．05），但生长方式有所不同。�
- 王璐刘永刚李芳菲姜蓉王亚平
- 关键词：原始生殖细胞胚胎生殖细胞扩增
- 人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点被引量：5
- 2006年
- 目的:探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法。方法:实验于2003-09/2004-12在重庆医科大学基础研究所完成。人胚胎来源为7～12周人工药物流产胎儿,由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供,征得产妇本人同意。①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞,经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞。②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原。③观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响,分析其生长特点并绘制生长曲线。④采用悬浮细胞培养法扩增细胞,冷冻复苏后观察细胞的生物学特性。结果:①人胚胎神经干细胞体外生长特点:从7～12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞。经体外传至15代,神经干细胞细胞数量扩增至200倍。②神经干细胞接种密度对增生的影响:当种植细胞的密度为1×105L-1,1×107L-1时,体外培养30d后仍呈单细胞贴壁状态。以1×109L-1细胞密度接种时,12h后即见多个单细胞聚成的小球,悬浮生长。③神经干细胞自我更新能力的检测结果:多数单个细胞在培养后24～48h分裂为2～4个细胞的小克隆,7～10d均发展为上百个细胞的较大的克隆。④nestin抗原的表达:培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性。⑤神经干细胞多向分化能力检测:NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示,被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着,呈阳性表达。⑥神经干细胞复苏后的存活率:冻存1,4,8,12周的神经干细胞存活率基本相似[(80.2±1.8)%,(80.1±1.2)%,(79.9±0.8)%,(80.1±2.1)%,P>0.05]。结论:成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞。经体外培养证明:人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能。
- 李英博王莎莉刘永刚李芳菲王亚平
- 关键词：干细胞胚胎大脑皮质细胞分化
- 人参多糖动员的造血干/祖细胞移植重建造血衰竭小鼠造血功能的研究
- 2006年
- 目的:探讨经人参多糖动员的外周血造血干/祖细胞移植对造血衰竭小鼠造血重建的作用。方法:建立小鼠造血衰竭模型,移植经人参多糖动员的外周血单个核细胞,检测受体小鼠生存时间,外周血WBC,脾湿重及脾集落数,进行染色体嵌合实验。结果:经人参多糖动员的雄性小鼠外周血MNC1×105个输注给致死剂量照射的雌性小鼠,可明显延长小鼠存活时间;提高受体小鼠外周血WBC数;亦能增加脾湿重,提高脾集落(CFU-S)数;经Y染色体检测(PCR法)受体小鼠外周血单个核细胞可检出581bpY染色体序列。结论:经人参多糖动员小鼠的外周血中存在数量较多的造血干/祖细胞,回输给造血衰竭小鼠能重建小鼠造血功能。
- 吴宏赵俊李芳菲王亚平
- 关键词：人参多糖动员造血重建
- 胎鼠胃上皮细胞增殖、凋亡与胃形态发生的关系
- 2007年
- 目的 研究胎鼠胃上皮细胞增殖、凋亡的时空规律及其与胃形态发生的关系。方法 每间隔0．5d取E11～15．5d小鼠整胎，横断连续切片，观察胃形态发生，体视学法测量胃贲门、幽门、大弯、小弯上皮分裂细胞密度（DMC）、凋亡小体密度（DAB）。结果①E11．5d胃开始发育，E12d胃底膨出，胃大、小弯出现。②上皮细胞DMC峰值均在DAB峰值之前。③贲门处DMC无明显峰值，DAB峰值在E11．5、12．5、13．5d；幽门处DMC峰值在E12．5d，DAB峰值在E14d；大弯DMC峰值在E11．5、12d时，DAB值持续较低；小弯DMC峰值在E11．5d，DAB峰值在E12．5d。结论 胎鼠胃上皮细胞的增殖及凋亡与胃发生有密切的时空关系。
- 林雪梅汪维伟李芳菲
- 关键词：胎鼠增殖凋亡
- 以转染白血病抑制因子基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞被引量：1
- 2007年
- 目的以转染白血病抑制因子(LIF)基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞,为建立无动物成分污染的人胚胎生殖细胞培养体系奠定基础。方法将LIF真核表达载体pcDNA3.1(+)-LIF转染到人胚肺成纤维细胞中,通过筛选和鉴定获得表达LIF的阳性细胞。将原始生殖细胞(PGCs)种植到转染后细胞制备而成的饲养层上,在不添加外源性LIF的条件下培养,并对PGCs来源的细胞集落进行鉴定。结果经RT-PCR及Western blotting鉴定证实,转染pcDNA3.1(+)-LIF的人胚肺成纤维细胞表达LIF基因。在转染后人胚肺成纤维细胞上生长的PGCs可形成典型的鸟巢状集落,经检测集落碱性磷酸酶活性呈强阳性,表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81,及未分化标志Oct-4。结论用转染LIF基因后的人胚肺成纤维细胞作为饲养层能支持PGCs来源人胚胎生殖细胞的生长,维持自我更新。
- 李芳菲刘永刚王建伟王莎莉王亚平
- 关键词：人胚肺成纤维细胞白血病抑制因子饲养层逆转录聚合酶链反应免疫印迹法人胚胎生殖细胞
- 小干扰RNA沉默胚胎生殖细胞Nanog基因的表达被引量：1
- 2010年
- 目的:建立胚胎生殖细胞中沉默多能干细胞特异转录因子Nanog表达的方法。方法:通过检测碱性磷酸酶、SSEA-1和Oct4标志蛋白,鉴定体外培养的胚胎生殖细胞(EG细胞),通过脂质体介导作用,将Nanog特异性小干扰RNA(siRNA)转染EG细胞,应用半定量RT-PCR检测转染24h、36h、48h后EG细胞中Nanog mRNA的表达水平,并应用免疫荧光技术检测转染36h、48h后EG细胞中Nanog蛋白的表达水平。结果:培养细胞具有高度碱性磷酸酶活性,SSEA-1、Oct4阳性,为保持未分化状态的EG细胞。转染后Nanog mRNA和蛋白表达均受到抑制。结论:脂质体介导siRNA能有效沉默EG细胞中Nanog基因的表达,为进一步探讨Nanog对胚胎生殖细胞的调控机制奠定了基础。
- 王璐何永林李芳菲彭彦姜蓉王亚平
- 关键词：胚胎生殖细胞小干扰RNANANOG
