杨学惠
- 作品数：31 被引量：69H指数：5
- 供职机构：首都医科大学附属北京胸科医院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家自然科学基金北京市优秀人才培养基金更多>>
- 相关领域：医药卫生文化科学更多>>
- 外源p53对人肺癌细胞生长的抑制被引量：2
- 1998年
- 目的 观察外源性野生型p53对有p53基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法 用PCR SSCP及DNA测序 ,选择p53突变的人肺巨细胞癌系 80 1 D。构建野生型p53表达质粒PZiP p53。用基因枪介导外源基因。经G41 8筛选得到转染细胞系 80 1 D p53。用PCR检测外源基因 ,观察转染细胞恶性生长的变化。结果 转染细胞系 80 1 D p53体外长期传代有外源性p53基因存在 ,转染细胞生长明显受到抑制 ,集落形成抑制率达 96% ,裸鼠异种移植致瘤性降低 ,肿瘤生长明显缓慢。结论 外源性野生型p53经基因枪导入有p53基因突变的人肺癌细胞后可长期存在于转染细胞中 ,且明显抑制所转染的癌细胞的恶性生长。
- 汪蕙赖百塘李金照蔡国平杨学惠张春燕刘桂芝韩岩湛秀萍刘晖
- 关键词：细胞系P53基因基因疗法
- p53C末端356～393氨基酸对人肺癌细胞恶性表型的影响被引量：8
- 2003年
- 目的 研究去除C末端 3 56～ 3 93氨基酸p53对人肺癌细胞恶性增殖抑制的影响。方法利用DNA重组技术 ,构建去掉C末端 3 56～ 3 93区 3 7个氨基酸残基p53和全长p53真核细胞表达质粒[pEGFP p53 (del) ,pEGFP p53 ]。p53缺失和突变的人肺癌细胞系 80 1D为受体细胞 ,lipofectin介导质粒转染细胞。G418筛选 ,建立转染克隆细胞系。以PCR、荧光显微镜检查外源基因的表达 ;以集落形成和裸鼠移植瘤试验检测细胞体内外恶性增殖能力 ;以移植瘤或接种部位细胞团印片检查荧光蛋白表达。结果 建立了转染克隆细胞系pEGFP p53 80 1D、pEGFP p53 (del) 80 1D和pEGFP 80 1D ,证明有外源p53基因存在和外源绿色荧光蛋白基因表达。pEGFP p53 (del) 80 1D体外集落形成抑制率为 99.6% ,pEGFP p53 80 1D为 81.1% ,pEGFP p53 (del) 80 1D细胞恶性增殖能力明显低于pEGFP p53 80 1D (P <0 .0 1)。pEGFP p53 (del) 80 1D形成的少数集落也有外源p53基因和绿色荧光蛋白表达。裸鼠移植瘤试验显示 ,对照组 80 1D和pEGFP 80 1D移植瘤为阳性 (4/ 4,4/ 4) ,pEGFP p53 (del) 80 1D和pEGFP p53 80 1D移植瘤为阴性 ,接种细胞部位仍有残留细胞团存在 ,有少数表达荧光蛋白的活细胞。结论去除C末端 3 56～ 3 93氨基酸的p53 。
- 汪蕙李金照赖百塘杨学惠张春彦岳文涛湛秀萍
- 关键词：P53蛋白肿瘤异质性氨基酸
- Ⅰ、Ⅱ相药物代谢酶遗传多态性与晚期非小细胞肺癌化疗疗效的关系被引量：3
- 2011年
- 背景与目的目前药物代谢酶遗传多态性与化疗疗效关系的研究结果多不一致,本研究旨在探讨细胞色素P4501A1(cytochrome P450 1A1,CYP1A1)、2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1)、2D6(cytochrome P450 2D6,CYP2D6)和谷胱甘肽硫转移酶M1(glutathione S-transferase M1,GSTM1)基因多态性与晚期非小细胞肺癌化疗疗效以及与肺癌患者预后的关系。方法采用PCR和PCR-RFLP技术对肺癌患者4种药物代谢酶基因分型,并对他们进行5年跟踪随访。结果携带B型CYP1A1和缺陷性GSTM1肺癌患者比其它基因型患者化疗疗效好(P<0.001)。携带A型CYP1A1肺癌患者接受非铂类化疗药物治疗比B型和C型患者疗效好(P=0.041);携带缺陷性GSTM1肺癌患者接受铂类化疗药物治疗疗效比功能型患者疗效好(P=0.011)。4种酶对晚期非小细胞肺癌患者总生存期(overall survival,OS)没有明显影响(P>0.05)。结论 A型CYP1A1肺癌患者接受非铂类化疗药物治疗比B型和C型患者疗效好;缺陷性GSTM1肺癌患者接受铂类化疗药物治疗比功能型患者疗效好。4种酶基因多态对晚期非小细胞肺癌患者OS影响没有明显统计学差异。
- 李伟英岳文涛杨学惠张春彦王玥
- 关键词：肺肿瘤药物代谢酶化疗效果
- 非小细胞肺癌患者中Survivin抗体的临床意义及诊断价值被引量：6
- 2010年
- 背景与目的在世界范围内,恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的主要原因,且其发病率和死亡率居高不下。随着人们对肿瘤标志物研究的不断深入,肿瘤相关的自身抗体成为了研究热点。肺癌患者血清中Survivin自身抗体的临床意义目前还存在争议。本研究旨在探讨Survivin自身抗体在非小细胞肺癌患者血清中可能的临床应用价值。方法采用RT-PCR方法获得Survivin cDNA,构建原核表达载体pET30a(+)/Survivin,亲和层析方法纯化蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定,建立基于Survivin融合蛋白的间接ELISA方法,对89例健康志愿者、215例非小细胞肺癌患者以及20例肺部良性疾病患者的血清样本进行检测。结果重组Survivin融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达,间接ELISA方法检测Survivin自身抗体在非小细胞肺癌患者血清中的阳性率为19.5%,特异性为88.9%,Survivin自身抗体与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小、远处转移间存在相关性(P<0.05),Survivin自身抗体与CEA在非小细胞肺癌患者中联合检测的阳性率明显高于CEA与NSE、SCC、CYFRA、ProGRP联合检测的阳性率,这大大提高了非小细胞肺癌检测的敏感性。结论本研究成功构建原核表达载体pET30a(+)/Survivin,并建立检测Sur-vivin自身抗体的间接ELISA方法,Survivin自身抗体与肺癌肿瘤大小、远处转移间的相关性及在非小细胞肺癌患者联合检测中的重要作用,为Survivin自身抗体在肺癌中的临床应用提供了线索和依据。
- 马丽岳文涛张丽娜王玥张春彦杨学惠
- 关键词：原核表达肺肿瘤间接ELISA
- p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响被引量：1
- 2002年
- 目的 研究外源p53反义RNA对有p53基因 2 4 8密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法 构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP p53(AS) ,经酶切图证明反向联结质粒。Lipofectin介导转染有p53基因 2 4 8密码点突变的人肺癌细胞系 80 1D ,经G41 8筛选获耐受克隆。稀释法建立单细胞克隆系 ,应用PCR检测外源基因 ,荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达 ,p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达 ,体外集落形成实验检测细胞生长 ,流式细胞仪检测细胞周期 ,MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性。结果 酶切图证明了p53 cDNA反向联结于质粒 ,构建了PEGFP p53(AS) ,并建立了转染单细胞克隆系PEGFP p53(AS) 80 1D及空载细胞系PEGFP 80 1D。PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系 ,而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达。免疫组化染色p53突变蛋白在 80 1D细胞系为阳性 ,而PEGFP p53(AS) 80 1D为阴性 ,证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达。与母系相比 ,PEG FP p53(AS) 80 1D集落形成抑制率为 61 % (P <0 .0 1 ) ,流式细胞仪检测该细胞系G1期细胞数明显增加 ,出现G1期阻滞的表现。MTT检测PEGFP p53(AS) 80 1D对顺铂比母系更为敏感。结论 有p53基因 2 4 8密码点?
- 汪惠赖百塘李金照杨学惠张春彦湛秀萍王玥
- 关键词：肺癌转染细胞表型顺铂敏感性基因治疗
- 制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达
- 2010年
- 背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scatter plot,FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达。方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scatter plot检测其GFP表达。结果测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失。Ad-(empty carrier)无p53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier)。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。
- 汪惠赖百塘李伟英杨学惠张春燕韦攀健李金照
- 关键词：野生型P53重组腺病毒
- 制备两种P53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达
- 2010年
- 目的P53作为转录因子在细胞应激时呈活化型，调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长，通常，通过各种机制P53呈非活化状态，其中包括P53C-末端负调控序列的作用。该研究目的是制备携带垒长和缺失这些负调控序列P53两种重组腺病毒和用流式细胞仪散点图（Flow cytometry scatter plot，FCM）检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）表达。材料和方法利用pAdEasy-Track载体系统，构建两种P53重组质粒并在细菌中产生重组体，转染L293细胞产生三种重组腺病毒。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞，FCM分析GFP表达。结果测序证明重组腺病毒：Ad—P53（del）缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区，Ad—P53（wtp）没有P53碱基缺失。Ad（empty carrier）无P53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端P53和全长p53两种重组腺病毒，Ad—p53（del），Ad-p53（wtp）及空载体Ad-（empty）。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠，可定量外源GFP表达，为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。
- 汪惠赖百塘李伟英杨学惠张春燕韦攀健李金照
- 关键词：野生型P53重组腺病毒
- 干扰COX-2基因表达对人肺腺癌A2细胞体外恶性增殖的影响被引量：2
- 2009年
- 背景与目的COX-2在多种肿瘤组织中高表达,参与了肿瘤的发生发展,RNA干扰(RNAi)技术是一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段。本研究应用RNAi技术研究干扰COX-2基因表达的抑制效果及抑制COX-2基因表达对A2细胞体外恶性增殖的影响。方法以COX-2为靶点,构建3个带有人U6启动子的COX-2小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)表达载体。用脂质体lipofectamine介导,分别将3个siRNA表达载体及空载体转染到COX-2表达阳性的A2细胞,建立转染细胞株。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成试验研究干扰COX-2基因表达对A2细胞体外增殖的影响。结果经过PCR扩增、内切酶鉴定、DNA测序和BLAST比对证实3个siRNA和U6启动子序列正确并准确克隆到pEGFP载体。转染细胞株分别命名为A2-3、A2-7、A2-10和A2-p。转染后24h、48h、72h,A2-p细胞均有绿色荧光表达,而A2-3、A2-7、A2-10细胞均未观察到绿色荧光。RT-PCR和Western blot结果显示,3个siRNA表达载体均发挥作用,COX-2表达受到抑制,与A2细胞比较,A2-3、A2-7、A2-10细胞的COX-2 mRNA表达量分别降低15.6%、20.4%和64.2%,COX-2蛋白表达量分别降低23.7%、36.7%和60.2%。细胞生长曲线、集落形成试验的结果显示,A2-10细胞生长减慢,集落形成率减少,而A2-3和A2-7细胞生长没有明显的改变。结论应用RNAi技术熄灭COX-2基因表达对A2细胞的体外恶性增殖有明显的抑制作用。
- 李伟英汪惠赖百塘杨学惠张春彦
- 关键词：CYCLOOXYGENASE-2RNA干扰体外肺肿瘤
- 脆性组胺酸三联体基因对人肺腺癌A549细胞恶性表型的影响被引量：1
- 2005年
- 目的研究外源性脆性组胺酸三联体(FHIT)基因在体内外对人肺腺癌A549细胞恶性表型的影响。方法用脂质体介导外源FHIT基因转染A549细胞,建立单克隆细胞系FHITA-549和PEGFP-A549。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、免疫组化方法检测外源FHIT基因在A549细胞的表达状况。采用细胞生长曲线、集落形成试验、流式细胞仪及裸鼠移植瘤试验研究外源FHIT基因对A549细胞体外增殖、凋亡、细胞周期和体内成瘤性的影响。结果RTPCR试验证实FHIT-A549中有FHITmRNA表达,免疫组织化学染色显示FHIT-A549细胞FHIT蛋白表达强阳性,而A549细胞和转空载体的PEGFPA549细胞FHIT基因和蛋白表达均阴性。FHIT-A549细胞的集落形成率为2.6%,显著低于A549细胞的50.1%和转染空载体PEGFPA549细胞的53.6%,三者相比差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪分析显示FHIT-A549细胞95.8%阻滞在G2期。FHITA549细胞移植瘤的瘤重为(0.04±0.03)g,显著低于A549细胞的(0.24±0.11)g和转染空载体PEGFPA549细胞的(0.25±0.07)g,三者差异有统计学意义(P<0.01)。结论A549细胞内外源FHIT基因的转导并表达能显著抑制其恶性增殖和分裂,诱导其凋亡,调节其细胞周期、抑制成瘤性。
- 张立群汪蕙赖百塘岳文涛湛秀萍杨学惠张春燕张同梅
- 关键词：细胞恶性表型FHIT基因流式细胞仪分析免疫组化方法细胞生长曲线细胞体外增殖
- 银染mRNA差异显示方法的建立和二次扩增参数优化被引量：11
- 2001年
- 张洪涛张春燕杨秋格杨学惠
- 关键词：MRNA银染基因扩增参数优化DDRT-PCR
