孙伟
- 作品数：4 被引量：2H指数：1
- 供职机构：华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 病毒肽/HLA-A2复合物与抗转铁蛋白受体单链抗体融合蛋白的构建、表达及鉴定
- 2010年
- 目的制备抗转铁蛋白受体单链抗体与病毒肽/HLA-A2的融合蛋白。方法利用重组DNA技术将HLA-A2基因和转铁蛋白受体单链抗体(TfRscFv)基因,用柔性的linker(Gly-4-Ser)3连接并克隆到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠埃希菌BL21(λDE3)菌株,获取重组子,经IPTG诱导表达目的蛋白。将纯化的目的蛋白和β2微球蛋白(β2m)与HLA-A2限制性的乙肝病毒(HBV)核心抗原肽HBcAg18-27在体外进行稀释复性,形成HBcAg18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白。利用ELISA和微球结合试验检测融合蛋白的空间构象。结果构建的融合蛋白基因具有正确的序列,经IPTG诱导后以包涵体形式表达的蛋白分子量正确,体外稀释复性后的融合蛋白具有正确的HLA-A2空间构象。结论成功构建了HBcAg18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白,为进一步将该融合蛋白通过其单链抗体加载到肿瘤细胞表面从而诱导乙肝病毒肽特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞奠定了物质基础。
- 李佳楠孙伟吴雄
- 关键词：HLA-A2转铁蛋白受体单链抗体
- HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化
- 2010年
- 目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoRⅠ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体。分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc]。对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Westernblot检测HLA-DR1的表达。结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。ELISA和Westernblot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象。结论成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础。
- 宋银宏刘燕牛力翁秀芳孙伟于倩吴雄文
- 关键词：二聚体杆状病毒载体昆虫细胞基因表达
- 共价连接β2m的HLA-A2/IgG1二聚体的构建、表达与纯化
- 2009年
- 目的HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2 m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白。方法利用基因重组技术构建β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-[β2 m-HLA-A2/IgG1],将其转染721.221细胞系,筛选高表达β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的细胞株;收集细胞培养上清,SPA亲合层析柱浓缩纯化,检测该蛋白的纯化效率。结果β2 m-HLA-A2/IgG1融合基因转染721.221细胞后可表达正确构象的β2 m-HLA-A2/IgG1二聚体,Western blot显示β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的分子量与预期大小一致;经SPA亲合层析柱纯化后,β2 m-HLA-A2/IgG1融合蛋白较HLA-A2/IgG1融合蛋白的纯化效率约高5倍。结论共价连接β2 m的HLA-A2二聚体有助于HLA-A2二聚体在低pH值的环境下保持构象完整。
- 郝娟段红霞李庆孙伟钟茂华翁秀芳吴雄文
- 关键词：真核表达
- 人结肠癌组织环加氧酶-2 mRNA剪接异构体片段分离与克隆被引量：2
- 2003年
- 目的 探讨人结肠癌组织中是否存在环加氧酶 2 (COX 2 )选择性剪接异构体的表达及其可能意义。方法针对人COX 2DNA第 7、 8外显子序列 ,设计一对全新引物 ,并采用RT PCR技术 ,从结肠癌组织中分离COX 2mRNA ,然后对电泳条带进行克隆、测序和分析。结果 正常结肠组织和结肠癌组织均发现COX 2目的条带 ( 2 5 2bp) ,但结肠癌组织则出现了一条新的电泳带 ( 5 34bp) ,经克隆和测序证实 ,该条带除目的条带的COX 2DNA的第7、 8外显子序列外 ,还包含第 7、 8外显子间的内含子序列 ,即保留的内含子 ( 2 82bp)。根据阅读框推测 ,在保留的内含子第 4 8～ 5 0碱基出现终止密码。结论 首次发现结肠癌组织中存在COX 2基因的选择性剪接异构体 (Genbankaccessionnumber:BU4 936 0 2 ,AY15 12 980 ) ,其所编码蛋白可能较已报道的COX 2酶蛋白小 ,且蛋白质的C末端缺少阿斯匹林作用位点。
- 万敬员叶笃筠吴萍黄云峰孙伟应红刚盘茜袁萍张代娟张力
- 关键词：人结肠癌组织环加氧酶-2克隆
