张雅昆
- 作品数：11 被引量：21H指数：3
- 供职机构：河北农业大学植物保护学院更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目国家自然科学基金河北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生化学工程更多>>
- 美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究
- 美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae)昆虫，是一种重要的世界性检疫害虫，也是我国重大入侵害虫之一。由于其寄主范围广、繁殖能力强和传播速度快等特...
- 张雅昆
- 关键词：美国白蛾苏云金杆菌氨肽酶N
- 美国白蛾氨肽酶N的基因克隆表达及与苏云金杆菌3种毒素蛋白的结合特性分析
- 2019年
- 美国白蛾(Hyphantria cunea)是桑树的重要害虫。为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白对该虫的作用机制,利用已知昆虫氨肽酶N基因序列设计引物,以美国白蛾中肠cDNA为模板,利用RACE-PCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N基因hcapn1全长序列(GenBank登录号:KP053647)。该基因开放阅读框为3 000 bp,编码999个氨基酸,预测蛋白质的分子质量和等电点分别为113.14 kD和4.85。设计去信号肽引物PCR扩增获得hcapn1基因序列,构建原核重组表达载体pET30a-hcapn1,诱导表达的HcAPN1重组蛋白约110 kD。将苏云金杆菌Cry1Ac、Cry2Ab33和Cry9Ea6原毒素经胰蛋白酶消化后与HcAPN1重组蛋白分别进行体外配体印迹试验,发现HcAPN1重组蛋白与Cry9Ea6结合,而不与Cry2Ab33、Cry1Ac发生特异结合,推测HcAPN1可能为Cry9Ea6在美国白蛾中肠的受体蛋白。分别设计引物扩增HcAPN1蛋白2个结构域Asp_(34)～Asp_( 527)和Leu_(563)～Gln_(925)的编码序列,在大肠埃希菌中表达获得62 kD和48 kD 2种重组蛋白,体外结合试验显示Cry9Ea6与HcAPN1的结合发生在Leu_(563)～Gln_(925)之间。研究结果为深入理解苏云金杆菌Cry9Ea6蛋白对美国白蛾的杀虫机制提供了基础数据。
- 刘子欢赵丹常梦颖张雅昆徐畅陆秀君郭巍
- 关键词：美国白蛾氨肽酶NBT蛋白
- 美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质被引量：9
- 2017年
- 【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA1&2的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn^(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg^(2+)对
- 闫晓平赵丹郭巍王伟张雅昆郜玉杰赵坤莉
- 关键词：美国白蛾克隆表达酶学性质
- 对甜菜夜蛾高杀虫毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ah5的克隆表达被引量：2
- 2016年
- 利用生物活性测定方法从本实验室已分离保存的Bt菌株中筛选出了5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的菌株。该5株Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC50值为0.556～0.914 mg/mL胞晶混合物,其中GS3菌株杀虫活性最高,LC50值为0.556 mg/mL胞晶混合物;包含晶体形态主要是球形、大菱形、小菱形等;所含基因类型主要是cry1Aa、cry1Ab、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ad、cry2Ah、cry7Ab、cry9Ba等;5株菌株均表达约60 kD和130～150 kD蛋白,其中2株还表达较弱的80 kD蛋白。从GS3菌株中克隆得到一种新的cry2A基因,Gen Bank登录号为KT692984,由Bt基因国际命名委员会命名为cry2Ah5。该基因开放阅读框为1899 bp,编码632个氨基酸,编码蛋白分子量为70.8 kD,等电点p I为8.18,与其他Cry2Ah蛋白序列相似性为97%～99%。该基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达约70 kD蛋白,与预测分子量相符。本研究筛选得到5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的Bt菌株,克隆表达了一种新的cry2A基因cry2Ah5,为甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株及基因资源。
- 张雅昆赵丹郭巍王伟陆秀君李瑞军
- 关键词：苏云金杆菌甜菜夜蛾CRY基因
- 对甜菜夜蛾高杀虫毒力的苏云金杆菌菌株的筛选及鉴定
- [目的]筛选对甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)具有高杀虫毒力的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株,并对其包含的cry基因类型、表达产物进行鉴定分析.[方法]利...
- 张雅昆赵丹郭巍
- 关键词：苏云金杆菌甜菜夜蛾杀虫活性CRY基因
- 华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶在不同体系中的表达被引量：2
- 2013年
- 丝氨酸羧肽酶(Serine carboxypeptidases,SCPs)是一类在酸性pH环境下参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节的真核生物蛋白水解酶。根据华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶(HoSCP)全长基因序列设计引物,利用PCR方法克隆hoscp基因并分别连接到表达载体pET28b和pPIC9K上,转化大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115,实现了其在原核以及真核体系中的表达。结果显示,HoSCP在原核细胞及酵母细胞中均能稳定表达50 kDa的特异蛋白。HoSCP的成功表达为其在华北大黑鳃金龟体内的活性和生物学功能研究提供了可能。
- 张雅昆赵丹郭巍刘小民徐大庆孙伟明
- 关键词：华北大黑鳃金龟原核表达系统毕赤酵母表达系统
- Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫(Holotrichia oblita)中肠微生物菌群的影响被引量：1
- 2017年
- Bt Cry8Ea蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫有特异的杀虫活性,通过中肠微生物宏基因组分析研究了Bt Cry8Ea蛋白与华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物的相互作用。解剖正常饲喂和饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita二龄幼虫中肠,提取中肠微生物宏基因组DNA,构建16S rDNA文库。利用PCR-RFLP方法分析两个处理中肠微生物16S rDNA酶切片段多态性(MspⅠ,RsaⅠ和HaeⅢ内切酶),不同克隆测序后与NCBI数据库进行对比分析,构建系统进化树,确定中肠微生物种属。结果显示,正常饲喂的华北大黑鳃金龟幼虫中肠微生物共检出30种细菌,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria):(Desulfosporosinus,29.63%);厚壁菌门(Firmicutes):梭菌属(Clostridium,12.59%)和芽孢杆菌属(Bacillus,10.37%),而饲喂Cry8Ea蛋白的华北大黑鳃幼虫中共检出4种细菌,优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes):肠球菌属(Enterococcus,50%)和链球菌属(Streptococcus,46.88%)。结果表明,饲喂Cry8Ea蛋白后,中肠微生物的菌群结构发生了明显变化。
- 王伟赵丹郭巍李新娜张雅昆闫晓平
- 关键词：华北大黑鳃金龟BTPCR-RFLP
- 华北大黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HoCDA5的分离及定位分析
- 2017年
- 为了获得华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)幼虫几丁质脱乙酰酶5(HoCDA5)及其在不同组织中的表达情况,本研究利用RACE-PCR方法扩增获得编码华北大黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶的cDNA基因hocda5(GenBank登录号:ANI87833),该基因的开放阅读框为1140bp,编码379个氨基酸,属于第V类CDA蛋白。在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功表达约42kDa的蛋白,制备了HoCDA5蛋白的多克隆抗体并对其进行效价测定。利用western blot方法分析了HoCDA5蛋白在不同组织,不同发育时期的表达情况。结果表明:该蛋白主要分布于围食膜,中肠,并且在中肠的前部含量最高,在幼虫的粪便中也检测到了较大量的HoCDA5蛋白,推测华北大黑鳃金龟幼虫的围食膜为I型,HoCDA5可能随着围食膜的新陈代谢排出体外。本研究成功克隆和表达了HoCDA5重组蛋白,制备了多克隆抗体,对该蛋白进行了组织定位分析,为进一步明确HoCDA5蛋白的功能提供了理论依据。
- 郜玉杰赵丹郭巍王伟张雅昆
- 关键词：华北大黑鳃金龟
- 华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶HoSCP的表达及活性分析
- 华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita Faldermann)属鞘翅目(Coleoptera)金龟总科(Scarabaeoidea)昆虫，幼虫称为蛴螬，是世界公认的危害严重且难于防治的地下害虫类群之一。其主...
- 张雅昆
- 关键词：华北大黑鳃金龟活性测定
- 暗黑鳃金龟几丁质酶基因的克隆、表达及活性分析被引量：1
- 2014年
- 本研究通过免疫筛选暗黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库,获得其几丁质酶基因Hpchi。序列分析表明Hpchi开放阅读框长1 443bp,编码480个氨基酸,预测分子量为51.4kDa。Hpchi蛋白N-端带有18个氨基酸的信号肽,C-端存在有一个几丁质结合结构域,催化区位置显示有特异活性位点,判定Hpchi蛋白属于Ⅰ型的几丁质酶。分别构建原核和真核表达载体,转化到大肠杆菌BL21和昆虫细胞系sf9,BTI-Tn-5BI-4(Highfive)中进行表达。SDS-PAGE和Western Bolt杂交试验显示,Hpchi重组蛋白在大肠杆菌及昆虫细胞系中都获得了成功表达。酶活分析表明真核表达的Hpchi重组蛋白具有几丁质酶活性。
- 邹爽赵丹郭巍徐大庆张雅昆
- 关键词：暗黑鳃金龟CDNA表达文库几丁质酶真核表达系统活性分析
