温丽敏
- 作品数：15 被引量：83H指数：4
- 供职机构：第二军医大学附属长海医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市卫生系统百名跨世纪优秀学科带头人培养计划广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 双功能抗体HER-2×CD3介导T淋巴细胞特异性杀伤功能的研究
- ＜正＞ 目的研究基因工程双功能抗体HER-2×CD3（BsAbHER-2×CD3）介导T淋巴细胞特异性杀伤过度表达HER-2乳腺癌细胞的作用。方法以过度表达HER-2的乳腺癌细胞株SK-BR-3为靶细胞,健康供体外周血分...
- 温丽敏王冠军马俐君赵丽纯朱迅
- 文献传递
- YCD基因修饰对小鼠P388白血病的体内治疗作用研究被引量：3
- 2003年
- 目的 :以P388/DBA小鼠白血病模型 ,探讨新型自杀基因YCD的体内治疗作用。方法 :用逆转录病毒载体将YCD基因导入 ,筛选P388 YCD eGFP细胞克隆 ,以P388 eGFP和野生性 (wt)P388细胞为对照。 (1) 3组细胞腹腔接种给DBA小鼠 (n =5 ) ,5× 10 6/只 (下同 ) ,观察致病性 ;(2 ) 3组细胞腹腔接种给DBA小鼠 (n =5 ) ,分别以 5 FC治疗 2周 ,观察疗效 ;(3) 2组× 5只小鼠腹腔接种P388 YCD eGFP ,5 FC 5 μmol/L·d-1× 2d或PBS治疗 ,根据小鼠存活时间推算杀伤效率。以流式细胞仪、冰冻切片和HE切片检测各脏器中白血病细胞的分布和变化。结果 :基因导入对细胞的生物学特性影响不显著 ;5 FC治疗 2周 ,YCD组小鼠存活 (17.8± 1.89)d ,而eGFP组和wtP388组分别存活 (7.8± 1.10 )d和 (7.7± 1.15 )d (P <0 0 5 ) ;5 FC治疗 2d的杀伤率达 99.6 %。结论 :YCD转基因细胞在体内可被 5 FC有效杀灭 ,该系统具有应用前景。
- 江千里王健民温丽敏张雨生江汕胡晓霞周虹
- 关键词：修饰小鼠P388白血病
- 西司他丁钠+亚胺培南消除细胞培养中细菌污染的研究被引量：5
- 2004年
- 目的 :研究西司他丁钠 +亚胺培南 (泰能 )清除细胞培养中细菌污染的可行性。 方法 :将 1 5批细胞培养中已发生细菌污染的细胞 ,用含泰能 1 0～ 1 0 0 μg/ ml的 PBS洗涤 3次 (PBS用量逐次递增 ) ,第 3次洗涤之前将细胞悬浮于含 1 0 0 μg/ m l泰能的完全培养液 1 .5 ml中 37℃孵育 30 min;然后细胞移入含 1 0 0 μg/ m l泰能的完全培养液中培养 ,更换含 1 0 0 μg/ ml泰能的完全培养液 1次 / d,共 3d。结果 :成功消除 1 4批细菌感染 ,另 1批加用万古霉素后亦获成功。结论 :泰能可以有效消除细胞培养中的细菌污染 。
- 江千里王健民江汕许育温丽敏周虹闵碧荷
- 关键词：西司他丁钠亚胺培南细胞培养细菌污染细胞生长
- 酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因MSCV载体的构建及原代T细胞表达
- 以自杀基因修饰供者T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的方案是一个巧妙的设计,而且在Ⅱ期临床试验中取得了明显的效果,但早期的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)自杀基因系统存在缺陷,促使研究者寻找新型自杀基因以替代之。研...
- 江千里王健民温丽敏周虹
- 文献传递
- 经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究被引量：17
- 2003年
- 目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl带有GFP 标记基因的病毒感染,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以流式细胞仪检测细胞eGFP+率。病毒滴度(TU/ml)=(2×105×细胞eGFP+率)/病毒原液体积。(2)LaSRT法:NIH3T3 细胞以5 000/孔接种于96 孔板,12 h后更换成完全培养液90 μl/孔,以8孔为一组,第1 孔中加入病毒液10 μl,此后每孔依次10∶1 倍比稀释,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以浓度自高到低的方向,在荧光倒置显微镜下确定计量孔(第n孔),计数孔中的阳性细胞数m。病毒滴度(TU/ml)=m×10n+1。(3)对7批病毒以LaSRT法研究,探讨冻存/复苏过程对重组病毒滴度的影响。结果经典方法测定的重组病毒滴度为(1.54±0.38)×106 TU/ml,LaSRT法测定的病毒滴度为(1.33±0.57)×106 TU/ml,两者无统计学差异(P>0.05)。LaSRT法可以大批量、快速地测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度。单次冻存/复苏后的病毒滴度为冻存前的(18.1±9.9)%(n=7)。结论LaSRT法和经典方法测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度,结果无统计学差异;
- 江千里王健民江汕温丽敏周虹
- 关键词：绿色荧光蛋白
- 绿色荧光蛋白标记的D氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究(英文)被引量：2
- 2004年
- 为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa D。以不同浓度的前药D Ala处理HeLa D细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa D细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa D细胞。前药D Ala能明显杀伤HeLa D细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞 ,DAAO/D
- 何志颖江千里陈元晓温丽敏姚玉成王新民李文林王健民胡以平
- 关键词：绿色荧光蛋白D-氨基酸氧化酶自杀基因报告基因宫颈癌
- 批量快速测定法测定标志基因为GFP的重组病毒滴度被引量：60
- 2002年
- 江千里王健民温丽敏江汕周虹
- 关键词：逆转录病毒腺病毒滴度
- RFP标记的YCD基因在HeLa细胞中的表达及其介导的细胞毒性
- 2004年
- 背景与目的 :探讨红色荧光蛋白标记的酿酒酵母菌胞嘧啶脱氨酶(YCD)基因在人宫颈癌细胞(HeLa细胞)中的表达及其功能。材料与方法 :采用基因重组技术构建含有CMV启动子和RFP、YCD基因开放阅读框(ORF)的真核表达载体pIRES_YCD ,脂质体法转染HeLa细胞。荧光显微镜下观察转染细胞中红色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率及荧光强度并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa_Y。以不同浓度的前药5_FC处理HeLa_Y细胞 ,MTT法检测细胞存活率。 结果 :荧光显微镜下可见红色荧光蛋白在HeLa_Y细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa_Y细胞。前药5_FC能明显杀伤HeLa_Y细胞 ,5_FC浓度与HeLa_Y之间存在对数曲线关系。结论 :RFP可作为报告基因快速筛选YCD表达载体转染的细胞 。
- 何志颖江千里姚玉成温丽敏李建秀王新民胡以平王健民
- 关键词：红色荧光蛋白自杀基因报告基因
- 酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用
- 2007年
- 目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)是新型自杀基因,利用重组逆转录病毒载体(RV),将YCD高效导入人原代T细胞,并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应。方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR,瞬时质粒共转染法制备RV,流动感染法或Retronectin+离心法感染人原代T细胞,嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR,检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能,在体外和SCID小鼠体内,探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等。结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106TU/mL。流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%,2轮离心+Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n=3)。经嘌呤霉素筛选48h获得T-YCD-puroR细胞,其基因阳性率96.7%±1.5%,并可大量扩增。与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义。体外实验显示,与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071mg/Lvs22.3mg/L),对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0μmoL/Lvs4.9μmoL/L)。T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠,7d后每只小鼠腹腔注射5μmoL的5-FC,连续7d,首次给药24h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45+细胞显著下降(P<0.01)。结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响,T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤。本研究为进一步研究打下了良好的基础。
- 江千里王健民张雨生温丽敏胡晓霞杨建民周虹
- 关键词：胞嘧啶脱氨酶基因自杀基因基因治疗T细胞
- eGFP标记肿瘤细胞小鼠模型的建立与应用被引量：4
- 2006年
- 目的:以携带绿色荧光蛋白基因(eGFP)的重组逆转录病毒(RV)标记肿瘤细胞,建立小鼠体内长期、系统肿瘤细胞研究模型,并初步探讨其应用。方法:制备高滴度eGFP-RV,感染小鼠白血病P388细胞,有限稀释法获得eGFP+的单细胞克隆;在体外和DBA/2小鼠体内,分别以流式细胞术、荧光倒置显微镜、冰冻切片和普通病理切片、半固体集落培养和PCR等方法,观察小鼠体内eGFP标记肿瘤细胞的效率、定位和时效。结果:eGFP基因导入率达80.2%,经克隆筛选后eGFP+率>99.2%。P388-eGFP细胞体外传代3个月后eGFP+率为95.2%,体内序贯接种(56.3±1.25)d后eGFP+率为(93.3±0.50)%(n=3)。eGFP基因导入未影响P388细胞的体内外生物学特性。多聚甲醛灌注固定法和液氮速冻法可有效保存组织中的荧光,灌注固定法制备的标本适用于多种病理和组化染色观察;外周血、肝、脾、脑等脏器中eGFP+细胞的分布、增殖,可用流式细胞仪和荧光显微镜等动态、定量观察,并可通过外周血的荧光细胞变化动态观察肿瘤细胞对治疗的反应;无菌获得的eG-FP+细胞可用于体外培养或体内序贯移植;PCR等技术可提高微量肿瘤细胞检测的敏感性。结论:成功建立的模型可在体内外以多种方法长期、动态、敏感地追踪观察荧光标记的肿瘤细胞,可广泛应用于肿瘤和细胞组织工程等领域。
- 江千里王健民江汕温丽敏胡晓霞周虹许小平
- 关键词：绿色荧光蛋白基因标记逆转录病毒载体灌注固定
