王健华
- 作品数：125 被引量：258H指数：9
- 供职机构：中国热带农业科学院热带生物技术研究所更多>>
- 发文基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 侵染多种病毒的辣椒cDNA文库构建及评价
- 辣椒是一种重要的蔬菜作物,生产上易受病毒病的影响.为了研究病毒与寄主互作的分子机制,本研究以感染多种病毒(至少包含2种Potyvirus和1种Tomovirus)的辣椒样品为材料,提取了包含根、茎、叶、花、果实、种子在内...
- 章绍延王健华谭老喜周朋张秀春张雨良刘志昕
- 关键词：辣椒POTYVIRUS酵母双杂交CDNA文库
- 高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备
- 高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一,引起甘蔗花叶病,对甘蔗产业危害很大.本研究根据SrMV外壳蛋白(coatprotein,CP)基因序列合成一对引物,...
- 王洪星龚殿孙玉娟张雨良王健华刘志昕
- 关键词：甘蔗外壳蛋白原核表达抗血清制备
- 文献传递
- 辣椒环斑病毒分子检测方法的建立及应用被引量：8
- 2012年
- 辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)是2007年在辣椒上发现的病毒新种,是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种。笔者于2009年首次在海南黄灯笼辣椒上检测发现ChiRSV。根据ChiRSV保守区域设计和筛选PCR特异引物,优化退火温度,对PCR产物进行序列测定,建立了ChiRSV的RT-PCR检测方法。通过灵敏度测定,结果表明该方法最低可检出12.5 pg病毒RNA,灵敏度高。通过对来自海南田间的疑似辣椒病样的RT-PCR检测,证实了该方法有良好的反应特异性,亦表明ChiRSV可能已在海南扩散。
- 王健华章绍延龚殿张雨良刘志昕
- 关键词：分子检测黄灯笼辣椒
- 香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备被引量：8
- 2010年
- 用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。
- 余乃通冯团诚王健华张雨良刘志昕
- 关键词：香蕉束顶病毒CP基因原核表达纯化
- 本生烟eIF4Es基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建被引量：1
- 2019年
- 由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病,是危害木薯的主要病害之一。目前尚无有效防治方法,并且特别是缺乏CBSV/UCBSV抗性育种材料。真核翻译起始因子4E(eukaryotie translation initiation factor4E,eIF4E)不仅参与蛋白质的翻译起始,并且Potyviruses的复制和翻译也依赖于eIF4E与病毒基因组连接蛋白(virus genome linked protein,VPg)的相互作用,目前发现的植物隐性抗病基因大部分都是eIF4E家族的等位基因。本研究利用生物信息学方法和RT-PCR技术获得本生烟(Nicotiana benthamiana)eIF4E家族的8个基因,聚类分析显示它们分别编码eIF4E、eIF4E的异构体和类似帽结合的蛋白。为筛选与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E家族蛋白,本研究进一步构建了这8个基因的Lex A-酵母双杂交系统的诱饵载体,并导入酵母细胞EGY48(p8op-LacZ)进行细胞毒性和自激活检测。结果显示导入重组质粒的EGY48(p8op-LacZ)酵母细胞在SD/-His/-Ura缺陷型培养基上生长良好,在SD/-Trp/-Ura缺陷型平板上不生长,并且在SD/Gal/Raf/-His/-Ura/X-Gal培养基上不显蓝色,说明重组质粒表达产物不仅对该酵母细胞无毒性,而且对下游报告基因无自激活作用,可用于该系统的互作蛋白筛选研究。本研究为利用酵母双杂交系统发现与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E基因,探索通过基因编辑与CBSV/UCBSV互作的寄主因子进行抗CBSV/UCBSV分子育种提供科学依据。
- 张春微张秀春陈柏岑武亚丹余乃通王健华刘志昕
- 关键词：酵母双杂交自激活
- 中国海南野番茄上的一种新病毒-野番茄花叶病毒
- 2015年
- [目的]鉴定引起海南水茄叶片呈典型皱缩和轻微花叶症状的病原物。[方法]对该病样提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后设计WTMV(Wild tomato mosaic virus)cp基因的特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为WTMV。[结果]通过PCR扩增获得一段约900 bp的DNA序列,包含WTMV全部CP(813 bp)蛋白基因编码区。分析表明该片段编码270个氨基酸,与WTMV-Laichua分离物核酸序列同源性为89%,氨基酸序列同源性为94%,且在所有的WTMV分离物中保守,可形成一个小的group。与其它马铃薯Y病毒属病毒的同源关系依次是PVMV、Chi VMV-Ⅰ、其它16个potyviruses(包括8个属于Chi VMV-Ⅱ的Chi VMV)。[结论]确定了引起海南水茄叶片皱缩和轻微花叶症状的病原物为野番茄花叶病毒(WTMV)。海南WTMV该分离物CP蛋白基因的Gen Bank登录号为KR781519。据我们所知,这是国内首次发现WTMV自然侵染水茄。
- 张真章绍延余乃通王健华龚殿刘志昕
- 关键词：反转录PCR番茄花叶病毒
- 一种APV1检测引物组及应用
- 本发明属于生物检测领域，具体涉及APV1检测引物组及应用。一组引物，包括两条外引物APV1‑F3和APV1‑B3，两条内引物APV1‑FIP和APV1‑BIP。本发明针对槟榔隐症病毒1型基因设计一套RT‑LAMP反应试剂...
- 王健华尹慧祥羊彬彬
- 一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法
- 本发明公开了一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’；反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’；其中...
- 章绍延王健华刘志昕张雨良余乃通张秀春周朋梁洁
- 文献传递
- 香蕉束顶病毒Haikou2分离物DNA2编码框原核表达及抗血清制备
- 2012年
- 香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产。BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究。本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2 ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备。结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3 h。融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清。Western blot实验表明抗血清具有特异性;酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954μg/mL浓度的表达纯化蛋白。
- 谭老喜王洪星张雨良王健华章绍延周朋余乃通刘志昕
- 关键词：原核表达抗血清制备
- 高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证
- 2012年
- 采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段。将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKT7-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用。研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础。
- 张雨良黄启星张树珍王健华余乃通刘志昕
- 关键词：CP酵母双杂交诱饵载体
