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人PD-L1胞外区基因的克隆、原核表达及抗体制备: 2010年; 目的克隆人PD-L1胞外区基因并进行原核表达及相应蛋白的抗体制备,为进一步研究PD-1/PD-L1通路及针对该通路进行疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法用PCR方法扩增编码人PD-L1胞外区的基因序列,克隆到原核表达载体pET28a(+)中并进行表达,用His抗体为一抗进行Western blotting鉴定并验证结合活性。用纯化的hPD-L1胞外区蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达质粒pET28a(+)-hPD-L1成功构建,并可在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导高效表达,得到的hPD-L1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确。用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度可达105。结论鉴定和纯化了原核表达的hPD-L1蛋白,制备的相应多克隆抗体能够检测真核细胞表达的hPD-L1蛋白,为进一步研究PD-1/PD-L1生物学活性奠定了实验基础。; 李斌刘朝奇王见之史继静覃晓琳吕佰瑞王梦瑶韩琴; 关键词：基因表达抗体

PD-L1高表达细胞对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响: PD-L1(Ligand of programmed death-1)作为免疫抑制性受体PD-1(Programmed death 1)的配体分子被发现广泛表达于多数肿瘤组织,并认为可能是肿瘤逃避免疫杀伤效应的机制之一。...; 王见之刘朝奇覃晓琳吕佰瑞汪龚泽; 文献传递

人sPD-1-Fc融合蛋白的构建及Cos-7细胞的表达: 2011年; 目的:构建重组人pSG5-Fc-hPD-1嵌合基因质粒,并在真核细胞进行表达,得到分泌性的sPD-1-Fc融合蛋白。为PD-1的生物学活性研究奠定基础。方法:从GenBank里查到人PD-1胞外区的基因序列,设计特异性引物,以人淋巴细胞cDNA为模板PCR扩增得到人PD-1胞外区片段。以pSG5-Fc真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pSG5-Fc-hPD-1。脂质体瞬时转染猴肾成纤维细胞(Cos-7),收取72 h的细胞上清。用Western blot鉴定,并与原核表达的人PD-L1蛋白免疫共沉淀检测生物学活性。结果:通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切及测序证实构建的重组质粒pSG5-Fc-hPD-1正确。重组质粒在Cos-7细胞中高效表达并分泌融合蛋白sPD-1-Fc到细胞上清,应用Western blot测定到上清中的融合蛋白,且得到的sPD-1-Fc融合蛋白具有与PD-L1结合的生物学活性。结论:通过基因重组方法在真核细胞里得到高效分泌型表达的sPD-1-Fc重组蛋白,为研究PD-1生物学活性奠定了实验基础。; 李斌刘朝奇王见之史继静吕佰瑞覃晓琳; 关键词：PD-L1 真核表达

PD-L1高表达的间质细胞通过诱导免疫耐受促进肿瘤生长的实验研究: 目的：前期的实验研究证明一定量的化疗药物,如顺铂处理肿瘤细胞之后,肿瘤细胞上 PD-L1的表达水平增高,这也是顺铂对于恶性肿瘤的治疗预后不好的原因之一。顺铂是不是也可以诱导肿瘤微环境中纤维细胞、血管内皮细胞等的PD-L1...; 王见之; 关键词：恶性肿瘤间质细胞免疫检测; 文献传递

PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型的建立及应用: 2011年; 目的通过构建重组的小鼠pcDNA3.1(+)-PD-L1质粒,并在真核细胞中进行高表达,建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型用于免疫调节药物的筛选。方法以RT-PCR方法扩增得到小鼠的PD-L1全长片段;以pcDNA3.1(+)真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1;脂质体转染到小鼠成纤维细胞(L929),通过G418筛选得到高表达PD-L1的稳定细胞株并经免疫荧光鉴定;用丝裂霉素处理过的PD-L1高表达细胞与小鼠脾淋巴细胞共培养;成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型之后向其中加入不同种类、不同浓度的天然产物提取物,并设复孔。结果通过Eco RI/Xho I双酶切及测序证实构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1正确。RT-PCR和免疫荧光方法鉴定重组质粒在L929细胞中高效表达,应用流式细胞术成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型,并筛选出阻断PD-L1活性的有效药物。结论获得了稳定高表达PD-L1的细胞,并且用于免疫调节的药物筛选,为免疫调节药物的筛选奠定了实验基础。; 王见之刘朝奇汪龚泽覃晓琳吕佰瑞; 关键词：PD-L1 真核表达小鼠脾淋巴细胞药物筛选

PD-1/PD-L1与Treg细胞相关性的研究新进展被引量：5: 2010年; PD-1和PD-L属于B7家族的共刺激分子,介导免疫反应的负性调节信号。Treg细胞是一个具有免疫调节作用的T细胞亚群,在机体的免疫耐受和免疫稳定中具有重要作用。本文就PD-1/PD-L1与Treg细胞的免疫调节作用及相关性研究进展作简要综述。; 王见之刘朝奇; 关键词：PD-1 PD-L1 TREG细胞免疫调节

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王见之