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整合荧光素酶的稳定细胞克隆建立裸鼠肺癌静脉移植瘤模型的探索被引量：4: 2012年; 目的:应用建立的整合荧光素酶的稳定细胞克隆构建裸鼠肺癌模型,并用活体成像技术检测肿瘤成瘤及变化。方法:细胞计数分析其生长特性,体外测定不同数量的细胞的发光强度;尾静脉注射接种BLAB/c nu/nu裸鼠,活体成像系统监测裸鼠体内肿瘤的生长及转移,肿瘤组织切片验证移植瘤的病理特性。结果:在稳定表达荧光素酶的SPC-A-1-luc+细胞基因组中能有效扩增到荧光素酶基因;该细胞系具有与母细胞相同的生长曲线,体外检测发现其发光强度与细胞数量呈正相关;尾静脉接种裸鼠后肺部成瘤率为100%,且信号强度随时间递增。结论:建立了稳定整合Luciferase基因的肺腺癌细胞株SPC-A-1-luc+稳定克隆,尾静脉接种后可有效构建肺部肺腺癌成瘤模型,并可动态监测肿瘤的生长及转移。; 张金栋吕景礼周问渠刘启才李晓艳; 关键词：荧光素酶 SPC-A-1细胞移植瘤活体成像

SEA和喉癌MAGE-A3基因重组真核共表达载体的构建及其在293T细胞的稳定表达: 目的构建葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal endotoxin A,SEA)和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-Associated Antigen A3,MAGE-A3)基因共表达的真核表达载...; 吉晓滨吕景礼陈敬贤刘启才谢景华

表达超抗原葡萄球菌肠毒素A的喉癌细胞的建立: 2013年; 目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达载体并建立其稳定表达的喉癌细胞系。方法:根据标准葡萄球菌菌株ATCC13565中SEA基因序列,人工合成其编码区序列,然后亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建pSEA-IRES-EGFP重组质粒,再将重组质粒转染至喉癌Hep-2细胞,G418筛选获得抗性单克隆,用RT-PCR和ELISA法鉴定SEA在喉癌细胞中的表达。结果:合成的SEA基因亚克隆至真核表达载体pires-EGFP后,测序证实克隆的SEA序列与GenBank中标准葡萄球菌菌株ATCC13565的编码区序列完全一致;重组质粒转染喉癌Hep-2细胞后,经筛选2周获得抗性单克隆,挑选单克隆,RT-PCR扩增获得特异的基因片段。经ELISA分析,发现细胞培养上清液中SEA蛋白的含量达pg级水平。结论:成功构建了超抗原SEA基因的重组真核表达载体,转染至喉癌Hep-2细胞后,SEA基因能够在细胞表达并持续分泌SEA蛋白。; 吉晓滨吕景礼刘启才谢景华; 关键词：超抗原葡萄球菌肠毒素A 真核载体基因克隆喉肿瘤

葡萄球菌肠毒素A和黑色素瘤抗原A3基因重组真核共表达载体的构建及其在293T细胞的表达被引量：2: 2012年; 目的构建葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal endotoxinA,SEA)和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(melanoma-associated antigenA3,MAGE-A3)基因共表达的真核表达载体,检测、鉴定其在293T细胞中的表达情况。方法分别用RT-PCR方法及人工化学合成法获得MAGE-A3和SEA基因片段,然后依次将MAGE-A3和SEA基因克隆至含内部核糖体进入位点的真核表达载体IRES序列的上、下游,构建成重组质粒pMGEA3-IRES-SEA。经脂质体转染至293T细胞以后,用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别鉴定SEA和MAGE-A3基因的表达。结果限制性内切酶酶切分析证实MAGE-A3和SEA基因均正确地克隆在pMAGEA3-IRES-SEA中,基因测序结果与GenBank公布的MAGE-A3、SEA序列完全一致,实现了双基因的正确重组。重组质粒转染293T细胞后能检测到MAGE-A3、SEA基因的高水平的有效表达。稳定表达双基因的293T细胞上清对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)增殖有促进作用,与细胞中SEA的表达和分泌有关。结论成功地构建了pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3和SEA蛋白,由此奠定了其作为抗喉癌DNA疫苗应用的基础。; 吉晓滨吕景礼陈敬贤刘启才谢景华; 关键词：葡萄球菌属超抗原真核细胞喉肿瘤

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定: 2012年; 目的:克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE-A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法:MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMD18-T载体。测序后将MAGE-A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成pIRES2-EGFP/MAGE-A3重组质粒经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE-A3基因的表达。结果:MAGE-A3基因正确克隆在pIRES2-EGFP/MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE-A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论:成功构建pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。; 吉晓滨吕景礼陈敬贤刘启才谢景华; 关键词：真核表达基因克隆喉肿瘤

SEA和喉癌MAGE-A3基因重组真核共表达载体的构建和鉴定被引量：1: 2012年; 目的构建超抗原SEA和喉癌来源的MAGE-A3基因共表达的真核表达载体,检测、鉴定其在293T细胞中的表达。方法分别用RT-PCR方法及人工化学合成法获得MAGE-A3和SEA基因片段,然后依次将MAGE-A3和SEA基因克隆至含内部核糖体进入位点的真核表达载体IRES序列的上、下游,构建成重组质粒pMAGEA3-IRES-SEA。经脂质体转染至293T细胞以后,用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别鉴定SEA、MAGE-A3基因的表达。结果限制性内切酶酶切分析证实MAGE-A3基因和SEA基因均正确地克隆在pMAGEA3-IRES-SEA中,基因测序结果与GenBank公布的MAGE-A3、SEA序列完全一致,实现了双基因的正确重组。重组质粒转染293T细胞后能检测到MAGE-A3、SEA基因的高水平表达。结论成功地构建了pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3和SEA蛋白,由此奠定了其作为抗喉癌DNA疫苗应用的基础。; 吉晓滨吕景礼陈敬贤刘启才谢景华; 关键词：超抗原喉肿瘤真核载体 MAGE-A3

慢病毒介导荧光素酶表达的人鼻咽癌细胞小鼠模型的建立被引量：2: 2013年; 目的:建立荧光素酶标记的人鼻咽癌细胞裸鼠模型,活体成像系统监测肿瘤的生长并与肿瘤的体积进行对比。方法:构建表达荧光素酶基因2(luc2)的慢病毒载体,与辅助质粒共转染293T细胞以制备慢病毒,感染人鼻咽癌SUNE1细胞后经嘌呤霉素筛选获得表达luc2的细胞株。活体成像设备体外检测不同数量细胞的发光强度,最后以5×106个细胞皮下接种BALB/c nu/nu裸鼠,活体成像系统动态记录接种后肿瘤的信号并与肿瘤的体积对比。结果:成功构建慢病毒表达质粒pLenti-luc2并包装出慢病毒颗粒,病毒感染后嘌呤霉素筛选6天得到鼻咽癌细胞株SUNE1-luc2。细胞株传代后有稳定的发光强度,且经活体检测的每秒光子数与细胞数成正相关(R2=0.96);活体成像观察发现裸鼠接种第2天接种部位的发光强度就达到3.2×108,而且成瘤过程中发光强度的变化与肿瘤大小一致。结论:成功构建适用于活体成像的人鼻咽癌SUNE1细胞的裸鼠成瘤模型,该模型从细胞接种开始即可有效动态监测鼻咽癌皮下瘤的生长及转移,从而为鼻咽癌的成瘤机制及药物干预研究提供一个新的手段。; 吕景礼李二毛李晓艳周问渠刘启才; 关键词：荧光素酶慢病毒活体成像

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吕景礼