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丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建被引量：1: 2015年; 目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法:基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T细胞)表位(NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180),2条HLA-A*1101限制性CTL表位(NS3609-617和NS5b251-259),1条HLA-A*2402限制性CTL表位(NS5b382-390)和2条Th(辅助性T细胞)表位(P73-15和NS5A276-288),合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pc DNATM3.1/myc-His(-)A;阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠,采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果:合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后,采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL,后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论:成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。; 李德周段志良郭江龙王思娜刘慧芳王志斌钟晓芝陈永平文金生; 关键词：丙型肝炎病毒细胞毒性T细胞表位 DNA疫苗

一种登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗制备和应用: 本发明公开了一种登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗，其是以真核表达质粒pcDNA3.1(-)为载体骨架，以Igκ链信号肽为引导序列，包含有登革病毒1型中15个高度保守的免疫优势CTL表位和1个通用型辅助性T细胞表位，各表...; 文金生段志良王思娜黄曦李静刘慧芳杨金霖; 文献传递

温州地区62例HCV感染者的基因型特征研究被引量：5: 2009年; 目的:探讨温州地区丙型肝炎病毒(HCV)感染者的HCV的基因型特征。方法:采用RT巢式-PCR法,对62例HCV-IgG阳性者进行HCV-RNA的检测及基因分型。结果:62例研究者中,HCV基因型1b单阳性率为35.48%,基因型2a单阳性率为3.23%,1b和2a双阳性率为61.29%,1b总阳性率为96.77%,2a总阳性率为50%。结论:温州地区HCV的基因型以1b型占优势,并且基因型1b和2a混合感染率较高。; 文金生段志良陈俊林荣方佩佩孟锐峰; 关键词：丙型肝炎病毒基因型聚合酶链反应

登革病毒特异性HLA-A*2402限制性表位肽及应用: 本发明首次揭示一组具有较高免疫原性的登革病毒特异性HLA-A*2402限制性表位肽。所述表位肽是登革病毒来源的，可诱导高水平的细胞毒性T淋巴细胞反应。; 文金生段志良郭江龙王思娜李静; 文献传递

丙型肝炎病毒HLA-A*1101和A*2402限制性CD8^+T细胞表位的研究被引量：2: 2014年; 目的:鉴定出丙型肝炎病毒(HCV)特异性HLA-A*1101限制性和A*2402限制性CD8+T细胞表位。方法:采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8+T细胞表位,合成HLA-A*1101限制性、A*2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A*1101阳性、A*2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A*1101或A*2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A*1101阳性或A*2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)后,采用酶联免疫斑点(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICS)实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素(IFN-γ)的细胞的水平和肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞的水平。结果:5条HLA-A*1101限制性候选表位中,NS3_609(ITLTHPITK)和NS2_165(VVFSDMETK)与HLA-A*1101分子具有高结合力。3条HLA-A*2402限制性候选表位中,NS3_373(KCDELASKL)和NS5b_382(YYLTRDPTI)与HLA-A*2402具有高结合力;在HLA-A*1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞,而在HLA-A*2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b_382特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞。结论:本研究证实NS3_609(ITLTHPITK)和NS2_165(VVFSDMETK)为全新的HCV特异性HLA-A*1101限制性CD8+T细胞表位,NS3_373(KCDELASKL)和NS5b_382(YYLTRDPTI)为全新的HCV特异性HLA-A*2402限制性CD8+T细胞表位。; 钟晓芝段志良郭江龙李强王思娜李静林荣文金生; 关键词：丙型肝炎病毒 CD8+T细胞表位

登革病毒特异性HLA-A*2402限制性表位肽及应用: 本发明首次揭示一组具有较高免疫原性的登革病毒特异性HLA‑A*2402限制性表位肽。所述表位肽是登革病毒来源的，可诱导高水平的细胞毒性T淋巴细胞反应。; 文金生段志良郭江龙王思娜李静; 文献传递

小鼠抗EV71衣壳蛋白VP1单克隆抗体的制备被引量：6: 2018年; 目的制备肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1特异性小鼠单克隆抗体(mAb)并检测其特异性。方法合成编码EV71-VP1的基因并克隆入原核表达质粒p ET21a;采用重组表达的VP1免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合并采用ELISA筛选可分泌抗VP1的m Ab的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,采用蛋白G亲和层析法从腹水中纯化mAb,并采用SDS-PAGE和Western blot法检测m Ab的纯度和特异性;EV71感染Vero细胞,采用间接免疫荧光细胞化学染色和Western blot法评估所制备m Ab识别EV71的能力。结果成功表达了EV71-VP1,制备出了4株杂交瘤细胞(6E、8D、9F和10C),杂交瘤细胞所分泌的小鼠m Ab均可识别EV71。结论成功制备了小鼠抗EV71衣壳蛋白VP1的m Ab。; 周湧超徐志刚杨澜陈新宇段志良文金生

登革病毒特异性HLA-A2限制性表位肽及应用: 本发明涉及登革病毒特异性HLA-A2限制性表位肽及应用。本发明表位肽是DENV-1非结构蛋白来源的、HLA-A2限制性的CTL表位，可诱导高水平的具有杀伤作用的CTL反应。; 文金生段志良张丽芳李文姝朱珊丽陈俊; 文献传递

登革病毒抗原肽免疫小鼠诱导特异性CD4^+ T细胞反应: 2009年; 目的:探讨4条登革病毒抗原肽在不同遗传背景小鼠中的免疫原性。方法:4条登革病毒抗原肽(C45-57KLV-MAFIAFLRFL,E396-408SSIGKMFEATARG,NS323-35YRILQRGLLGRSQ和NS3141-155NREGKIVGLYGNGVV)中每条肽分别免疫BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠;3周后,处死小鼠并制备脾细胞悬液;不刺激或同样抗原肽刺激脾细胞后,采用细胞内细胞因子染色流式细胞术(ICS)检测小鼠脾细胞CD4+ T细胞中肽特异性产生IFN-γ或IL-4的CD4+ T细胞的百分比。结果:肽C45-57可诱导BALB/c小鼠产生特异性的IFN-γ+ CD4+ T细胞(0.72%±0.04% vs 0.04%±0.02%,P<0.05)而肽E396-408则诱导产生特异性的IL-4+ CD4+ T细胞(0.09%±0.01%vs0.01%±0.01%,P<0.05);肽E396-408、NS323-35和NS3141-155均可诱导C57BL/6小鼠产生特异性的IFN-γ+ CD4+ T细胞(分别为0.31%±0.03%vs0.02%±0.01%,P<0.05;0.21%±0.03% vs 0.04%±0.01%,P<0.05;0.44%±0.04% vs 0.02%±0.01%,P<0.05),而肽C45-57可诱导产生特异性的IL-4+ CD4+ T细胞(0.45%±0.05% vs 0.02%±0.02%,P<0.05)。结论:肽C45-57和E396-408在BALB/c小鼠中具有免疫原性而肽C45-57、E396-408、NS323-35和NS3141-155在C57BL/6小鼠中具有免疫原性。; 段志良孟锐峰文金生; 关键词：登革病毒 CD4+T细胞

登革病毒血清型2 E蛋白Ⅲ区单克隆抗体的制备及其诊断特异性研究被引量：1: 2019年; 本研究旨在制备抗登革病毒(dengue virus,DENV)血清型2 (DENV2)E蛋白Ⅲ区(envelope protein domainⅢ,EDⅢ)单克隆抗体(简称单抗)并研究其诊断特异性。合成编码DENV2-EDⅢ的基因并将其克隆入原核表达质粒pET21a;将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21;用重组表达的EDⅢ免疫小鼠;将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合;将可产生识别抗EDⅢ单抗的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔;采用蛋白G亲和层析法从腹水中纯化单抗;采用间接ELISA和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)评估所制备的单抗识别DENV血清型1～4 (DENV1～4)的能力。本研究成功表达了DENV2-EDⅢ,并制备出3株杂交瘤细胞,杂交瘤细胞所分泌的小鼠源性单抗既可识别DENV2,又可交叉识别DENV1、DENV3和DENV4。; 段志良周湧超杨澜陈新宇陈新宇金胜威; 关键词：登革病毒单克隆抗体

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段志良

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