陈小禾
- 作品数：21 被引量：136H指数：7
- 供职机构：四川大学华西医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程更多>>
- nm23-H_1基因对人肺癌细胞中细胞外信号调节激酶活性的影响被引量：8
- 2004年
- 目的 探讨肿瘤转移抑制基因nm2 3 H1 对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中细胞外信号调节激酶ERK1/2活性的影响。方法 应用特异性识别总ERK1/2 ( p44 /4 2MAPkinase)和双磷酸化ERK1/2( phospho p44 /4 2MAPkinase)的抗体及蛋白印迹法 (Westernblot) ,检测L9981(缺失nm2 3 H1 基因的原代肺癌细胞株 )、L9981 nm 2 3 H1 (转染了nm 2 3 H1 基因的L9981细胞株 )、L9981 PLXSN (转染了空载体的L9981细胞株 )中总ERK1/2和磷酸化ERK1/2的水平。磷酸化ERK 1/2活性应用非放射性免疫沉淀和Westernblot法以及 p44 /4 2MAPkinase分析试剂盒予以检测。 结果 L9981 nm2 3 H1 细胞株中磷酸化ERK 1/2的水平 ,以及ERK1/2活性均显著低于L9981细胞株和L9981 PLXSN细胞株 (P <0 .0 1) ,L9981和L9981 PLXSN细胞株间磷酸化ERK 1/2水平和ERK 1/2活性比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。三个细胞株间总ERK1/2水平比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 nm2 3 H1 基因可明显靶向地抑制人高转移肺癌细胞株L9981中ERK 1/2的转录表达和ERK 1/2的活性。推测nm2 3 H1 基因的作用机制可能与其抑制了MAPK/ERK信号传导通路有关。
- 李印周清华孙芝琳覃扬朱文王艳萍刘伦旭陈小禾孙泽芳
- 关键词：NM23-H1基因肺癌癌细胞信号传导通路
- 人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究被引量：5
- 2008年
- 目的研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果。方法1用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;2MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;3将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用。结果1转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;2GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照,转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;3pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%)。结论hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。
- 王艳萍唐小军周清华车国卫陈小禾朱大兴
- 关键词：自杀基因端粒酶催化亚单位靶向性表达
- 利用定点突变技术构建突变nm23-H_1和EGFP融合基因被引量：7
- 2006年
- 背景与目的以前的研究已经证明nm23H1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23H1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23H1EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23H1S44A、nm23H1P96S、nm23H1H118F、nm23H1S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23H1P96SS120G,构建了突变型nm23H1EGFP融合基因。结果成功构建了nm23H1S44AEGFP、nm23H1P96SEGFP、nm23H1H118FEGFP、nm23H1S120GEGFP、nm23H1P96SS120GEGFP五个突变型nm23H1EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23H1EGFP融合基因。QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。
- 朱大兴周清华王艳萍朱文陈小禾孙芝琳
- 关键词：定点突变NM23-H1EGFP
- 小鼠Ras激酶抑制剂(KSR)基因氨基端和羧基端真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达被引量：1
- 2006年
- 背景与目的已有的实验证据表明,Ras激酶抑制剂(kinasesuppressorofRas,KSR)的功能主要是作为一个支架蛋白组装MAPK及其上游调控子形成多蛋白的复合体。但KSR是否存在激酶活性,一直是争论的焦点。本研究的目的是构建小鼠KSR基因氨基端(NKSR)和羧基端(CKSR)的真核表达载体,并观察其在293T细胞中的表达。方法通过PCR方法扩增NKSR和CKSR目的片段,利用基因重组技术构建pCMVTag2bNKSR和pCMVTag2bCKSR真核表达载体,并进行酶切和测序鉴定。鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞,通过Westernblot方法检测目的蛋白的表达。结果通过酶切和测序鉴定,pCMVTag2bNKSR和pCMVTag2bCKSR真核表达载体序列正确,编码框正确。转染后的293T细胞经Westernblot检测,能够表达目的蛋白。结论成功构建了pCMVTag2bNKSR和pCMVTag2bCKSR真核表达载体并可在293T细胞中表达,为以后的研究奠定了基础。
- 杨雪琴周清华朱文朱大兴马力李昌林王艳萍陈小禾马家宝
- 关键词：真核表达基因重组
- 端粒酶催化亚单位基因启动子调控Hsv—tk/GCV系统对肺癌细胞A549选择性杀伤作用的研究被引量：11
- 2007年
- 目的研究人端粒酶催化亚单位（human telomerase catalytic subunit，hTERT）基因启动子调控单纯疱疹胸苷激酶／更昔洛韦（herpes simplex virus-thymidine kinase／ganciclovir，Hsv-tk／GCV）治疗系统对人肺癌细胞株A549的选择体外杀伤作用。方法（1）用脂质体法将hTERT启动子和sv40启动子调控的比基因表达质粒（pGL3-hTp-tk和pGL3-sv40-tk）转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5，用逆转录-PCR方法检测转染细胞中此基因的表达情况；（2）用MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用；（3）用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡和细胞周期的影响。结果（1）转染pGCS-sv40-tk的细胞A549、MRG5和转染pGCS-hTp-tk的A549均有tk mRNA表达，转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无tk mRNA表达；（2）GCV对转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGCS—hTp-tk的A549体外增殖均有明显抑制作用，对转染pGL3-hTp-tk的MRG-5无明显抑制作用；（3）转染pGL3-sv40-tk的A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549细胞，GCV处理后细胞凋亡指数（21．58％、9．35％和23．19％）均显著高于转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞（0．78％和0．55％）及空白对照A549和MRC-5细胞（2．17％和0．60％），转染pGL3-hTp-tk的MRC-5细胞凋亡指数（0．88％）无明显升高。结论hTERT启动子调控Hsv-tk基因可以在肺癌细胞中选择性表达，hTERT调控的Hsv-tk／GCV治疗系统对肺癌细胞体外增殖具有靶向性抑制作用。
- 唐小军王艳萍周清华车国卫陈小禾朱大兴
- 关键词：肺癌自杀基因端粒酶催化亚单位
- 人肺癌细胞株L9981-nm23-H_1的建立被引量：8
- 2004年
- 目的 建立转染野生型nm2 3 H1 基因的人大细胞肺癌细胞株L9981 nm2 3 H1 。方法 应用基因克隆技术构建逆转录病毒载体pLXSN nm 2 3 H1 EGFP。脂质体法转染PA3 17细胞 ,得到逆转录病毒 ,并将病毒感染L9981细胞 ,获得L9981 nm 2 3 H1 。应用PCR和Westernblot检测L9981 nm2 3 H1 细胞中nm2 3 H1基因及其蛋白表达。结果 成功构建了逆转录病毒载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP。nm2 3 H1 cDNA导入到L9981细胞株中 ,并检测到L9981 nm 2 3 H1 细胞中有nm 2 3 H1 蛋白表达。结论 nm 2 3 H1 基因在细胞株L9981 nm2 3 H1 中能持续。
- 车国卫周清华王艳萍陈军刘伦旭覃扬孙芝琳陈小禾朱文
- 关键词：NM23-H1基因肺肿瘤
- nm23-H_1基因点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的GSK-3β激酶活性的影响被引量：5
- 2006年
- 背景与目的我们的前期研究结果表明nm23-H1基因的肺癌转移抑制作用可能与上调Wnt信号通路中关键激酶GSK-3β的活性、进而抑制Wnt信号通路相关。本研究的目的是探讨nm23-H1点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中胞质和胞核的GSK-3β激酶活性的影响,为阐明nm23-H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据。方法将原代人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980、原代人高转移大细胞肺癌细胞株L9981、空载体转染细胞株L9981-pEGFP、稳定转染nm23-H1基因的细胞株L9981-nm23-H1-pEGFP以及稳定转染在44、96、118、120号位点发生突变后的nm23-H1基因的转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1H118F-pEGFP和L9981-nm23-H1S120G-pEGFP作为研究对象,应用免疫共沉淀同位素闪烁计数法测定上述肺癌细胞株胞质和胞核中的GSK-3β激酶活性。结果nm23-H1基因发生点突变后,所有转基因肺癌细胞株细胞胞质和胞核中的GSK-3β活性均较突变前有所下降。L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1H118F-pEGFP、L9981-nm23-H1S120G-pEGFP分别与L9981-nm23-H1-pEGFP比较,胞质与胞核中GSK-3β激酶活性均存在显著性差异(P<0.05),其中L9981-nm23-H1P96S-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP胞质中GSK-3β活性存在极显著差异(P<0.01),L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP和L9981-nm23-H1H118F-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP的胞核中GSK-3β活性存在极显著差异(P<0.01)。结论①nm23-H1基因突变能显著影响其对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981胞质和胞核中GSK-3β激酶活性的调控作用;②nm23-H1基因可能通过调控L9981中GSK-3β激酶活性来抑制L9981细胞株中Wnt信号传导。
- 马力周清华朱文朱大兴杨雪琴王艳萍陈小禾张敏高利伟赵颖
- 关键词：NM23-H1基因GSK-3Β点突变
- 利用Pyrobest DNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变被引量：4
- 2007年
- 目的:介绍一种简单、快速、高效和经济的进行大片段基因定点突变的方法。方法:小量抽提含有NM23H1-EGFP融合基因的逆转录病毒真核表达质粒pLXSN-NM23H1-EGFP,体外合成突变引物对,利用高保真Pyrobest DNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用DpnⅠ限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,取适量消化产物转化大肠杆菌XL1-Blue,随机挑选克隆进行测序筛选、鉴定所需突变株。结果:在NM23H1-EGFP基因中引入了S44A、P96S、H118F、S120G、P96S-S120G等5个替换突变位点及9bp处的插入突变。结论:该方法简单、快速、高效、经济,不须纯化中间产物,不须亚克隆,突变效率几乎为100%,是一种值得推广应用的方法。
- 朱大兴周清华王艳萍车国卫唐小军朱文陈小禾孙芝琳
- 关键词：DNA聚合酶定点突变
- 转染nm23-H_1基因靶向阻断人大细胞肺癌细胞株L9981 Wnt信号传导通路被引量：5
- 2004年
- 目的 探讨nm2 3 H1 基因转染靶向阻断人高转移大细胞肺癌细胞株L9981Wnt信号传导通路的可行性 ,为阐明nm2 3 H1 基因调控肺癌转移抑制的分子机制和靶向治疗提供实验依据。方法 以转染nm 2 3 H1 基因的L9981 nm 2 3 H1 、原代L9981、空载L9981 pLXSN三株人高转移大细胞肺癌细胞为研究对象 ,应用Westernblot检测比较各株肺癌细胞胞浆、胞核中Wnt信号传导通路关键激酶GSK 3 β和 β 连环蛋白表达的变化。结果 ①GSK 3 β在L9981 nm 2 3 H1 肺癌细胞胞浆中表达量IOD( 63 41± 5 41)显著高于L9981( 373 6± 2 98)和L9981 pLXSN( 3 613± 3 83 ) (P <0 .0 0 1) ;②GSK 3 β在L9981 nm2 3 H1 肺癌细胞胞核中表达量IOD( 4 3 5 6± 490 )显著高于L9981( 65 7± 5 7)和L9981 pLXSN ( 70 5± 75 ) (P <0 .0 0 1) ;③β 连环蛋白在L9981 nm 2 3 H1 肺癌细胞胞浆中表达量IOD( 3 64 9± 118)显著高于L9981( 14 0 1± 3 1)和L9981 pLXSN ( 13 5 0± 5 5 )(P <0 .0 0 1) ;④β 连环蛋白在L9981 nm 2 3 H1 肺癌细胞胞核中表达量IOD( 2 945± 68)与L9981( 2 60 4± 2 3 )和L9981 pLXSN( 2 65 2± 5 3 )比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;⑤L9981与L9981 pLXSN两者间GSK 3 β和β 连环蛋白在肺癌细胞胞浆和胞核的?
- 付军科周清华朱文王艳萍刘伦旭陈小禾聂强李定彪李印
- 关键词：L9981GSK-3ΒΒ-连环蛋白
- nm23-H1基因转染L9981肺癌细胞前后基因表达谱的变化被引量：6
- 2006年
- 应用基因芯片检测L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞基因表达谱的改变.提取L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞的总RNA,纯化为mRNA后再转录为cDNA.cDNA经限制性内切酶Sau3AI消化后,cDNA片段分别用cy3和cy5标记,与定制的包含14000个基因芯片杂交.杂交结果经扫描和软件分析,nm23-H1基因转染L9981细胞后发现1156(8.26%,1156/14000)个基因表达上调,而642(4.59%,642/14000)个基因表达下调.涉及基因包括信号传导、癌基因与抑癌基因、转移相关基因、细胞周期与凋亡、细胞外基质与细胞骨架相关基因,以及细胞因子和转录因子等.nm23-H1基因是通过对转移相关基因的调节来发挥其抑制肺癌细胞株L9981侵袭和转移作用的.
- 车国卫周清华覃扬王艳萍陈小禾朱文孙芝琳
- 关键词：L9981基因表达NM23-H1基因
