孙军峰
- 作品数：18 被引量：29H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金黑龙江省自然科学基金青岛市科技发展计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 表达EGFP蛋白新型重组新城疫病毒疫苗载体的构建被引量：2
- 2017年
- 为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达外源蛋白,在p NDFLSP-m F的P基因与M基因之间引入PmeⅠ酶切位点,并将EGFP基因编码区克隆至构建好的p NDFLSP-m F载体中,构建含有EGFP基因的重组质粒p NDFLSP-m F-EGFP。将p NDFLSP-m F-EGFP以及辅助质粒p CI-NP-K、p CI-P-K、p CI-LK共转染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,拯救获得了重组病毒La Sota-m FEGFP。通过RT-PCR证明,被拯救的重组病毒中含有插入的外源基因EGFP。荧光观察和Western-blot分析结果表明,EGFP蛋白能在重组病毒中稳定表达。生物学特性测定结果显示,La Sota-m F-EGFP具有低毒力毒株特征,MDT为144 h,能够在鸡胚上有效地复制,EID50为1×108.75/0.1 m L。上述研究结果为研制和开发新型NDV载体疫苗奠定了基础。
- 赵冉齐甜铭孙军峰刘怀然韩宗玺杨孝朴刘胜旺
- 关键词：新城疫病毒绿色荧光蛋白
- 基因Ⅶ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：4
- 2010年
- 根据基因ⅤⅡ型新城疫病毒F基因裂解位点特征设计一对引物和TaqMan探针,建立一种敏感、特异、重复性良好的基因ⅤⅡ型毒株荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。以体外转录法制备的cRNA标准品为标准阳性模板,构建标准曲线,并进行各项指标的检测。结果表明,建立的方法特异性良好,最低可检测到102拷贝·μL-1的模板RNA,敏感性比普通RT-PCR高100倍。本试验建立了基因ⅤⅡ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法,且该方法能够鉴别检测常规方法不能区分的新城疫病毒基因ⅤⅡ型强毒株,表明本研究建立的方法可用于此种基因型毒株的快速鉴别检测。
- 孙军峰刘华雷王志亮赵云玲郑东霞张维刘文华冯莉莉常娓娓
- 关键词：新城疫病毒荧光定量RT-PCR
- Ⅰ类新城疫病毒分离株NDV08-046的基因组特性被引量：3
- 2011年
- 对1株Ⅰ类新城疫病毒分离株NDV08-046进行了全基因组序列测定和遗传进化分析。结果表明,该分离株基因组长度为15198 nt,符合＂六碱基原则＂。与Ⅱ类新城疫病毒的基因组序列相比,该分离株在基因组P基因的2381~2382 nt的位置（根据La Sota株的基因组序列,包含15186 nt）有12 nt的插入（TGGGAGACGGGG）。NDV08-046株F蛋白裂解位点的序列为112-ERQERL-117,具有典型的新城疫弱毒株特征。全基因组的遗传进化分析显示,所有的新城疫毒株能够被分为2个明显不同的分支,即Ⅰ类和Ⅱ类,NDV08-046分离株在分类地位上属于Ⅰ类新城疫病毒基因2型。
- 刘华雷孙军峰赵云玲张维管峰刘文华郑东霞李金明王志亮
- 关键词：基因组序列遗传进化分析
- 表达基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白重组LaSota疫苗株的构建被引量：2
- 2017年
- 基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)为我国NDV的主要流行病毒株,而经典疫苗株LaSota不能对鸡群起到有效的免疫保护。为研发针对NDV基因Ⅶ型流行病毒株的疫苗,本研究采用反向遗传操作技术,将LaSota的F基因编码区(CDS)替换为基因Ⅶ型流行病毒株CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因CDS,并将替换后的F蛋白的裂解位点突变为LaSota的裂解位点,构建重组质粒pNDFLsp-mF。将pNDFLsp-mF与表达NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞,拯救获得表达基因Ⅶ型NDV F蛋白的重组病毒(rLaSota-mF)。生长曲线结果显示,与LaSota相似,rLaSota-mF能够在鸡胚中有效复制,病毒滴度EID50为109.375/0.1 mL。生物学特性测定结果显示rLaSota-mF的MDT为144.6 h,表明其为低毒力病毒株。将拯救获得的病毒连续传15代后所替换的基因及突变的位点能够在r LaSota-mF中稳定存在。本研究为研究与开发针对NDV不同基因型流行病毒株的疫苗奠定基础。
- 赵雯刘瑞菊孙军峰刘怀然韩宗玺刘胜旺
- 关键词：F蛋白裂解位点
- 一株新城疫病毒野鸟分离株的生物学特性研究
- 2018年
- 野鸟是新城疫病毒(NDV)重要的自然宿主,在NDV的传播和进化中起着重要作用。Mallard/CH/HLJ127/06是2006年分离自黑龙江省野鸟的一株NDV。本研究对其进行了全基因组序列测定、遗传进化分析、抗原相关性分析;并测定了病毒株毒力指标及致病性特点。结果显示Mallard/CH/HLJ127/06属于class II中的基因VII型病毒株。F蛋白裂解位点为^(112)RRQKRF^(117)。抗原相关性分析表明Mallard/CH/HLJ127/06与基因VII型代表性病毒株之间没有显著的抗原性差异。致病指数MDT (最小致死剂量病毒致死鸡胚的平均时间)值为68 h,ICPI (脑内接种致病指数)值为1.975。致病性试验结果显示,SPF鸡感染Mallard/CH/HLJ127/06后表现明显的临床症状,在感染鸡的脑、气管、肺脏、腺胃、盲肠扁桃体、肾脏和肝脏中均能够检测到病毒的RNA。本研究为进一步研究野鸟在NDV流行病学中的作用及对我国新城疫的防控提供了依据。
- 梁甜甜孙军峰韩宗玺刘胜旺刘怀然
- 关键词：野鸟新城疫病毒生物学特性
- 基因Ⅶ型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析被引量：1
- 2021年
- 目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-optiF。通过SWISS-MODEL网站对蛋白结构进行预测,结果显示,质粒pCAG-optiF编码的蛋白能够形成与人呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象相似的结构。将质粒pCAG-optiF转染至鸡源细胞LMH中,通过间接免疫荧光试验证实构建的蛋白在鸡源细胞中成功表达。将质粒p CAG-optiF转染悬浮培养的Expi293F细胞,表达并纯化获得重组蛋白roptiF。SDS-PAGE电泳结果显示获得了与预期大小相符的蛋白。Western-blotting结果显示,表达的roptiF蛋白能够与NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的抗血清反应。进一步通过负染色电子显微镜观察roptiF蛋白结构,结果显示,roptiF蛋白具有典型的F蛋白融合前构象的结构特征。本研究成功获得了具有融合前构象的基因Ⅶ型NDV F蛋白,并且该蛋白能够与抗NDV的血清反应,本研究结果为研制新型NDV疫苗奠定了基础。
- 陈林娜孙军峰李乐师乾凯邸涛刘添仪赵冉张春玮韩宗玺刘胜旺
- 关键词：新城疫病毒F蛋白
- I类和II类新城疫病毒复合RT-PCR鉴别诊断技术
- 刘华雷王志亮赵云玲郑东霞王君玮张维徐天刚吕燕李金明孙军峰孙承英吴延功左媛媛于松梅
- 1.任务来源：青岛市科技发展计划项目，项目名称：小反刍兽疫等重大动物疫病快速检测技术研究，项目编号：07-2-3-5-jch。2.应用领域和技术原理：主要应用于国内新城疫疫情诊断、检测、监测、流行病学调查等。技术原理：针...
- 关键词：
- 关键词：新城疫病毒动物疫病
- 基因VII型新城疫病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术
- 刘华雷王志亮徐天刚赵云玲郑东霞王君玮张维吕燕李金明孙军峰孙承英吴延功左媛媛于松梅
- 1.任务来源：青岛市科技发展计划项目。项目名称：小反刍兽疫等重大动物疫病快速检测技术研究，项目编号：07-2-3-5-jch。2.应用领域和技术原理：主要应用于国内新城疫疫情诊断、检测、监测、流行病学调查等。技术原理：通...
- 关键词：
- 关键词：诊断试剂流行病学调查
- 新城疫病毒复制对其溶瘤作用影响的初步分析
- 2020年
- 本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检测NDV在各细胞系的蛋白表达水平;利用流式细胞术检测NDV感染对各细胞系的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,NDV在三个细胞系内的基因组复制水平和蛋白表达水平没有显著差异,但对三个细胞系的溶瘤作用存在明显差异;进一步流式细胞术检测发现,NDV感染能诱发HEK293T和HCT116的细胞周期发生G1期停滞,但对A549的细胞周期没有明显影响;此外,NDV感染24 h后,A549细胞以早期凋亡为主,而HCT116细胞以坏死/晚期细胞凋亡为主。NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且NDV对不同类型肿瘤细胞的溶瘤作用存在不同机制。
- 吴寒光孙军峰梁雨萌刘胜旺李海
- 关键词：新城疫病毒溶瘤病毒细胞周期
- 体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板被引量：4
- 2010年
- 本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。
- 孙军峰刘华雷张维王志亮
- 关键词：新城疫病毒体外转录
