李荣凤
- 作品数：54 被引量：133H指数：7
- 供职机构：南京医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划内蒙古自治区自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 用于异种移植的新型基因改造猪的培育被引量：1
- 2014年
- 目的培育用于异种移植的新型基因改造猪,在α-Gal基因敲除以及膜辅蛋白CD46、血栓调节蛋白(TM)基因转入的基础上,进一步将Ⅱ类反式激活因子基因N端缺失显性负向(CⅡTA-DN)基因转入猪胎儿成纤维细胞,以抑制猪白细胞抗原(SLA)Ⅱ类分子的表达。方法设计合成博来霉素(Zeocin)抗性基因片段,并将其与含有CⅡTA-DN基因的pST205载体连接,构建置于人Tie2增强子和CMVβ-actin启动子下游的pNMU105/CⅡTA-DN表达载体,将线性化的pNMU105通过脂质体转染法转入已经敲除了α-Gal并转入CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B(DKO/CD46/TM)。Zeocin抗性筛选转染pNMU105质粒的181B细胞,PCR方法检测CⅡTA-DN基因在181B细胞中的转入,获得阳性单克隆并进行核移植,得到DKO/CD46/TM/CⅡTA-DN转基因猪。取仔猪的耳缘组织裂解后进行基因鉴定。结果成功设计Zeocin抗性基因片段并构建pNMU105/CⅡTA-DN表达载体,经过质粒转染和Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆,顺利通过核移植得到转基因猪。仔猪耳缘组织经PCR鉴定,在592 bp位置检测到预期条带,证明均为CⅡTA-DN转基因阳性。结论通过新型基因改造猪的培育,在抑制超急性排斥反应和补体反应、降低凝血和人CD4+T细胞免疫反应的理论基础上进行了转基因模型猪的构建,为异种移植中更加有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活做出了新的尝试。
- 李倩坤王盈张曼玲杨海元程俊霖赵丽华任子健陈凤娇万振昆张纬李荣凤戴一凡
- 关键词：异种移植
- GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除猪作为异种心脏瓣膜供体
- 张润洁王荣根方斌李楚陈雷任雪洋厉小雪熊强张立宁金永张曼玲刘晓蕊王盈杨海元李荣凤戴一凡
- 雌牛生殖道内游离氨基酸含量的测定与分析
- 在牛体外受精研究中,目前普遍在培养液中添加Sigma或Gibco生产的氨基酸溶液进行胚胎发育培养。商品氨基酸溶液的配方最初都是针对细胞培养而设计,是否能为胚胎发育提供最适的氨基酸环境尚未见研究报道。哺乳动物雌性生殖道内游...
- 李荣凤温立华王树英旭日干
- 文献传递
- 诱导性多潜能干细胞的研究进展被引量：1
- 2010年
- 作为生命科学界一大热点领域的干细胞研究一直备受关注,而诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,简称iPSC或iPS细胞)的产生具有里程碑的意义。从2006、2007年日本美国科学家先后发表对小鼠与人诱导性多潜能干细胞的研究成果至今,短短三年时间,iPS细胞的研究领域以惊人的速度和影响范围发展,又有了很多新的进展与突破,并荣登2007年NatureScience times年度十大科学成果突破榜及2008年Science年度十大科学成果突破榜榜首。本文概述了诱导性多潜能干细胞的研究背景、研究方法和进展、在哺乳动物中的研究范围和应用现状,最后提出了展望和有待解决的问题,以期为诱导性多潜能干细胞研究者进行更深入的研究提供一定的借鉴。
- 萨日娜李喜和李荣凤
- 关键词：诱导性多潜能干细胞哺乳动物
- 氨基酸在牛体外受精胚发育过程中的作用及其代谢量的研究
- 该研究探讨了氨基酸对牛IVF胚胎发育率和冷冻解冻存活率的影响,分析了不同发情时期母牛输卵管液和子宫液的游离氨基酸种类及含量,并在化学成份明确的培养系统的基础上,探讨生理浓度的氨基酸对胚胎发育和冷冻解冻存活率的影响,另外,...
- 李荣凤
- 关键词：体外受精胚胎发育率
- 文献传递
- CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立被引量：1
- 2018年
- 目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。
- 王俊政李艳如赵丽华刘曼菱张曼玲金永陈俏羽王晨宇尤志欢李荣凤
- 奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化
- 2013年
- 通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。
- 孙伟巴特尔郭继彤李荣凤王建国李明胡树香王春生李喜和
- 关键词：奶牛体细胞去核核移植
- 猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备
- 2022年
- 目的:从巴马小型猪SALL1的蛋白结构出发,分析其与人SALL1蛋白的同源性,进一步制备Sall1基因敲除的巴马小型猪胎儿成纤维细胞系,为通过体细胞核移植技术获得猪肾脏发育缺陷模型提供实验材料。方法:利用生物信息学方法分析人、猪、鼠SALL1的蛋白结构。利用在线设计软件,在猪Sall1基因第1外显子区域设计单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)并将其连接至PX330质粒,构建猪Sall1基因敲除打靶载体。在初步转染细胞的基础上,通过Sall1基因测序分析验证PX330-sgRNA载体打靶效率,最后将打靶载体转染至原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过药物筛选获得单克隆细胞并鉴定其基因型。结果:生物信息学分析表明,相比小鼠,猪的SALL1蛋白与人SALL1蛋白具有更高的同源性。成功构建猪Sall1基因敲除打靶载体,并获得33个单克隆细胞系,经基因测序鉴定得到16个Sall1双等位基因敲除的细胞系。结论:生物信息学方法验证了人和猪SALL1蛋白具有更高的同源性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Sall1基因敲除细胞系,为研究Sall1基因在猪肾脏发育过程中的作用提供研究材料,并为下一步获得猪肾脏缺失模型奠定基础。
- 李美双赵丽华李荣凤
- 关键词：蛋白结构
- 整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立
- 2017年
- 目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的相关研究奠定基础。方法:以PEF细胞c DNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体p TRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1(975bp)、LIN28(727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体(p TRE3G-Zs-OCT4、p TRE3G-Zs-TBX3、p TRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与p EF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。
- 张曼玲陈袁赵丽华李艳如金永王俊政姜海滨陈俏羽李荣凤
- 关键词：IPS细胞
- 牛肌肉生长抑制素基因敲除打靶载体的构建被引量：2
- 2012年
- 【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素(myostation,MSTN)基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和6.8 kb同源长臂;经过限制性内切酶酶切鉴定,证实两套载体的同源臂分别正确插入到基础载体内。【结论】两套牛MSTN基因敲除打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN构建成功,载体pPLP-MSTN为不含负筛选标记的传统基因敲除打靶载体,载体PⅢ-MSTN为不含负筛选标记的荧光蛋白启动子捕获打靶载体。
- 赵丽华梁浩云亭李荣凤
- 关键词：胎儿成纤维细胞
