耿亚维
- 作品数：6 被引量：15H指数：3
- 供职机构：江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程理学更多>>
- 脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2-甲基丁酸及其酯被引量：3
- 2009年
- 2-甲基丁酸手性中心碳原子上的基团差异较小,是一种典型的酶法动力学拆分较为困难的风味化合物.本文分别在不同体系中比较了几种商品化脂肪酶和华根霉脂肪酶(RCL)催化酯化和水解反应对2-甲基丁酸及其酯的拆分,结果表明,RCL不仅在非水相中具有一定的选择性酯化能力,而且在水相中具有更强的选择性水解2-甲基丁酸乙酯的能力,在40oC下优先水解(S)-型底物,反应10h后(R)-2-甲基丁酸乙酯的ee值为92.4%.进一步考察了温度对RCL催化酯化拆分与水解拆分的影响,结果表明,低温下反应的对映体选择性较高,在4oC下通过水解拆分获得的(R)-2-甲基丁酸乙酯的ee值可提高至95.0%.
- 李小路王栋徐岩耿亚维陈聪王楠
- 关键词：动力学拆分
- 一种新型(S)-羰基还原酶的克隆及其功能表达被引量：6
- 2010年
- 【目的】从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)基因组中钓取新型(S)-羰基还原酶基因(scrⅡ),对其生物转化手性醇的功能进行了验证。【方法】采用PCR的方法,从C.parapsilosis基因组中扩增出一段可能的羰基还原酶基因scrⅡ。以构建的重组菌Escherichia coli BL21/pET28a-scrⅡ为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行催化反应,经HPLC分析,计算终产物的光学纯度和产率,确定了转化反应的最适温度和pH值。【结果】scrⅡ基因全长为840bp,编码279个氨基酸,与已报道的(S)-羰基还原酶基因scr的一致性为85%。氨基酸序列分析表明SCRⅡ具有典型短链醇脱氢酶的功能域:辅酶结合区域Thr40-Gly41-(X)3-Gly45-X-Gly47和催化三联体结构Ser172-(X)n-Tyr187-(X)3-Lys191。在30℃,0.1mmol/LIPTG的诱导下,(S)-羰基还原酶(SCRⅡ)在E.coli中过量表达。以10%(w/v)的重组菌为催化剂,高浓度(6g/L)2-羟基苯乙酮为底物,在最适反应温度35℃和pH5.5的条件下,转化产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度高达99.1%e.e.,产率为89.6%。与(S)-羰基还原酶SCR相比较,底物浓度提高了一倍,产物的光学纯度和产率分别提高了10%和28%。【结论】采用分子克隆技术分离出新型羰基还原酶SCRⅡ的编码基因,该酶的发现为手性醇的高效制备奠定了坚实的研究基础。
- 耿亚维张荣珍王珊珊徐岩
- 关键词：基因克隆生物转化
- (R)-、(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位
- 2011年
- 【目的】将增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中表达,分析荧光蛋白表达谱,确定两种酶在细胞中的功能分布和亚细胞定位。【方法】采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白与(R)-和(S)-羰基还原酶的融合基因,构建到真核表达载体pYX212中,电击转化酵母细胞,以荧光蛋白为筛选标志,观察两种酶在酵母细胞中的表达和分布。【结果】激光扫描共聚焦显微观察表明(R)-和(S)-羰基还原酶多定位于细胞内膜和细胞质中稳定表达,少数成点状分布于细胞中央。根据荧光强度可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。生物转化结果显示融合型(R)-和(S)-羰基还原酶催化底物2-羟基苯乙酮,分别获得(R)-和(S)-苯基乙二醇,前者产物的光学纯度和产率为86.6%和70.4%,后者产物的光学纯度和产率分别为92.3%和81.8%。【讨论】荧光蛋白与酶的融合没有改变靶蛋白的分子构象与生物活性,酿酒酵母工程菌较重组大肠杆菌具有更明显的生物功能优势,该研究为羰基还原酶蛋白的功能表达调控与亚细胞定位的可视化研究奠定了坚实的基础。
- 张荣珍徐岩王珊珊张波涛耿亚维
- 关键词：羰基还原酶酿酒酵母亚细胞定位苯基乙二醇
- 羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联催化制备(R)-苯基乙二醇被引量：2
- 2009年
- 以重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh全细胞为催化剂,2-羟基苯乙酮和甲酸钠为双底物,研究了生物催化反应体系中温度、pH值、底物2-羟基苯乙酮的初始浓度、反应时间、细胞浓度和状态等对产物(R)-苯基乙二醇生成效率的影响规律.结果表明,在温度35℃和pH7.0、底物初始浓度6g/L、时间36h、湿细胞浓度10%(ω)的条件下,产物的光学纯度高达98.37%e.e.,得率达79.14%.在上述反应体系中添加5mmol/LZnSO4后,重组菌催化的不对称还原反应效率显著提高,产物(R)-苯基乙二醇光学纯度达到100%e.e.,得率高达86.3%.
- 张荣珍徐岩耿亚维王珊珊孙莹
- 关键词：重组大肠杆菌生物催化光学纯度
- mRNA翻译起始区二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的表达及催化效率被引量：4
- 2009年
- 为了提高近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的表达水平及催化效率,对酶编码基因mRNA翻译起始区中+1～+78区进行二级结构的优化,并构建了相应的突变体。优化后mRNA翻译起始区的发夹结构明显减少,自由能显著下降(由原始的?9.5kcal/mol降至?5.0kcal/mol),使酶蛋白的表达水平及粗酶比活力分别比优化前提高了4～5倍和61.9%。在高底物浓度(5.0g/L2-羟基苯乙酮)下,优化突变株不对称转化效率较高,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为93.1%e.e.和81.8%,比优化前提高了27.5%和40.5%。研究结果表明:优化mRNA翻译起始区的二级结构,克服蛋白翻译启动的空间位阻,不仅能促进翻译的顺利进行,使目标蛋白得到高效表达,而且有利于蛋白空间结构的正确折叠,有效提高酶蛋白活力及生物催化功能。
- 王珊珊张荣珍耿亚维沈伟谭念江王磊徐岩
- 关键词：翻译起始区MRNA二级结构
- (R)与(S)-羰基还原酶偶联一步法制备(S)-苯乙二醇被引量：2
- 2009年
- 【目的】通过(R)-和(S)-羰基还原酶在大肠杆菌中偶联,实现了一步法制备(S)-苯乙二醇的生物转化过程。【方法】将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶基因(rcr)和(S)-羰基还原酶基因(scr)串联于共表达载体pETDuetTM-1上。重组质粒pETDuet-rcr-scr转化稀有密码子优化型菌株Escherichia coli Rosetta,获得酶偶联重组菌株E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-scr。当重组菌体培养至OD6000.6～0.8时,添加终浓度1mmol/L IPTG,30℃诱导蛋白表达10h。【结果】SDS-PAGE结果表明(R)-和(S)-羰基还原酶均明显表达,它们的相对分子质量分别为37kDa和30kDa。重组菌生物转化结果表明:在pH7.0的磷酸缓冲液中,添加5mmol/L Zn2+时,获得产物(S)-苯乙二醇,产物光学纯度为91.3%e.e.,产率为75.9%。【讨论】采用分子重组技术成功整合了两种氧化还原酶的催化功能,实现了(S)-苯乙二醇的一步法转化,为简化手性醇制备途径提供了一条崭新的思路。
- 张荣珍徐岩孙莹耿亚维
- 关键词：羰基还原酶生物转化
