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Per1和Per2基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立被引量：1: 2006年; 蔡彦宁左晓虹刘姝谢淑温玫陈彪; 关键词：PER1 PER2 实时荧光聚合酶链反应

利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达被引量：2: 2006年; 目的建立一组灵敏的检测时钟基因(c lock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况。方法培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系。利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况。结果确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子。利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整。结论巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整。时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用。; 关云谦蔡彦宁谢淑朱宛宛徐艳玲张愚陈彪; 关键词：巢式聚合酶链反应时钟基因单细胞

时钟基因在胚胎干细胞分化为神经元过程中的表达特征被引量：2: 2007年; 目的检测小鼠胚胎干细胞(ES)体外向神经元诱导分化过程中,7种重要时钟基因的表达情况。方法小鼠胚胎十细胞(ES),经过5个阶段诱导分化为神经元。各阶段细胞的总 RNA反转录为 cDNA,利用7种时钟基因的特异引物进行 PCR 反应,以明确其随分化表达的情况。结果各个时钟基因无非特异扩增,BMAL1、CLOCK、CRY1和 CRY2、PER1、PER3基因在各个分化阶段中都表达,而 PER2基因只在终末阶段被检测到。结论时钟基因的转录在 ES 细胞向神经元分化的过程中并不一致,提示在成体动物存在的时钟基因环路,在 ES 细胞向神经元分化过程中还没有建立。PER2 仅在分化终末期——大量停止分裂的神经元和胶质细胞出现的时期才转录,提示其可能在细胞增殖过程中发挥某种作用。; 谢淑蔡彦宁关云谦武文琪徐艳玲张愚陈彪; 关键词：胚胎干细胞细胞分化神经元节律基因

C57小鼠肝、肾、脾、胸腺组织时钟基因的表达特点被引量：6: 2007年; 目的探测不同脏器组织中时钟基因的表达水平及其波动性。方法用实时荧光定量PCR方法检测C57小鼠肝、肾、脾和胸腺中4种重要时钟基因mBMAL1、mPER1、mCRY1和mCRY2的表达。结果肝和肾中4种时钟基因的表达水平均有显著波动(P<0.01);而脾中仅mBMAL1、mPER1、mCRY1的节律性表达明显(P<0.01,P<0.001,P<0.05),并且波动振幅较为平和;胸腺中4种时钟基因的表达均不具备昼夜波动的特征,同时表达水平也与其他3种组织存在显著差异(P<0.01)。时钟基因所构成的环路在不同组织中也不尽相同,mPER1的负反馈效应在肝中较为主要,mCRY1和mCRY2的负反馈效应在肾和脾中较为主要。结论不同周围组织的分子时钟存在着显著的差异,其相关正负反馈元件和环路有待进一步研究阐明。; 刘姝蔡彦宁谢淑关云谦陈彪; 关键词：昼夜节律时钟基因实时荧光定量PCR

利用荧光定量聚合酶链反应检测小鼠纹状体中Per1基因的表达规律被引量：3: 2006年; 目的建立定量检测Per1 mRNA表达水平的系统,并检测小鼠纹状体中该基因的表达规律。方法提取小鼠纹状体总RNA,用Per1基因特异性引物进行聚合酶链反应(PCR),以荧光染料SYBR green I法进行实时检测。结果确定了Per1基因荧光定量的扩增和检测参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且扩增效率在90%以上。利用此检测体系发现小鼠纹状体内Per1基因的表达呈节律性波动。结论所建立的方法能够定量测定Per1 mRNA表达水平,具有灵敏度高,线性范围广的特点。纹状体中Per1基因表达的节律性波动提示黑质纹状体系统间的相互调节可能具有昼夜节律性差异。; 蔡彦宁左晓虹刘姝谢淑温玫陈彪; 关键词：PERL SYBR 纹状体

MPTP对C57小鼠纹状体DA释放节律的影响被引量：1: 2006年; 目的观察MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)对C57BL/6J小鼠纹状体DA(多巴胺)、5-HT(5-羟色胺)等神经递质的释放节律性的影响。方法取120只SPF级C57BL/6 J小鼠,随机分为2组:MPTP组连续5 d腹腔注射MPTP-HCl 36mg/(kg.d),对照组注射生理盐水300μL。5 d后24 h内分6个时间点:ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20,取纹状体,用HPLC-ECD法检测各时间点2组纹状体中DA、5-HT的水平。结果MPTP组纹状体DA水平明显降低(P<0.05);对照组DA高峰出现在ZT0(即8:30 am),低谷在ZT16(即1:30 am),MPTP组DA的高峰和低谷出现的时相未发生改变。2组5-HT均无明显节律性释放。结论小鼠纹状体的DA水平呈节律性变化,5-HT无节律性变化,MPTP作用后对DA的节律性变化无影响。表明此模型纹状体DA的减少与DA释放节律性之间不存在必然联系。; 左晓虹陈彪蔡彦宁吴燕川刘姝谢淑温玫; 关键词：MPTP 多巴胺昼夜节律

小鼠胚胎干细胞移植后两种示踪方法的比较: 2010年; 目的观察小鼠胚胎干细胞(ES)移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白(GFP)质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点。方法标记方法一:将p-EGFP-N1质粒转入ES细胞,连续10代抗生素筛选表达GFP的GFP-ES,并将GFP-ES移植入活体大鼠脑内。取材后冰冻切片,在荧光显微镜下观察切片上的绿色荧光。标记方法二:直接移植胚胎干细胞后取材,用特异性抗小鼠Thy-1抗体作移植细胞的免疫组织化学染色,荧光显微镜下观察。另外,两种标记方法均做神经元和胶质细胞的特异抗体神经细胞核抗体(NeuN)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学染色,观察是否与GFP或Thy-1抗体双标记,以此判定细胞分化情况。结果 GFP质粒转化后的ES细胞团和单细胞均表达亮绿色的GFP,转化效率为30%;移植21d后,大鼠脑内存活的移植细胞仍表达GFP,但不能和NeuN、GFAP的染色双标记。大量Thy-1阳性的植入细胞和NeuN、GFAP双标记。结论 GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞,但不能观察细胞分化;而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果,还可以准确地标记分化细胞。; 关云谦谢淑孙静敏邹春林陈凌张愚; 关键词：绿色荧光蛋白胚胎干细胞分化

含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达被引量：4: 2008年; 利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体转染了人胚胎来源的神经干细胞,探讨了转染后GDNF在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素。首先GDNF基因被克隆入慢病毒载体,通过瞬时转染法包装出病毒上清,经滴度鉴定后分别按拷贝数为1、2.5、5、10转染神经干细胞。转染后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF的神经干细胞体系。其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验中构建了表达GDNF基因的慢病毒载体,包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞,经潮霉素筛选可以得到均一的持续表达分泌GDNF的人胚胎皮层神经干细胞体系。实验结果表明转染拷贝数可以影响GDNF的分泌水平,相同条件下转染拷贝数越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高。因此,含GDNF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的神经干细胞,使其持续表达GDNF,转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。; 王淑艳任萍谢淑朱宛宛王暘关云谦张愚; 关键词：胶质源性神经营养因子神经干细胞慢病毒载体

中国帕金森病患者儿茶酚-O-甲基转移酶及单胺氧化酶B基因的多态性分析被引量：2: 2015年; 目的研究中国帕金森病患者儿茶酚-O-甲基转移酶（eatechol-O-methyltransferase，COMT）及单胺氧化酶B（monoamineoxidaseB，MAOB）基因的多态性分布。方法研究对象为由中国帕金森病研究协作组收集的来自全国共29个研究中心的1408例帕金森病患者。抽取静脉血提取基因组DNA，应用DNA自动测序仪，采用Sanger双脱氧链终止法检测COMT和MAOB的基因型。结果COMTrs4680AA、AG、GG基因型的频率分别为8．9％、42．0％、49．1％；COMTrs4818CC、CG、GG基因型的频率分别为42．5％、45．6％、11．9％；MAOBrs1799836A／AA、AG、G／GG基因型的频率分别为74，4％、14．1％、11．5％；COMTrs4680和MAOBrs1799836基因型同时为高活性的比例为36．86％。结论中国帕金森病患者COMT及MAOB基因多态性分布特点具有其独特特征，可能与帕金森病患者药物疗效差异存在一定的相关性。; 郝宏莹邵明安静陈楚霜冯秀丽谢淑顾朱勤陈彪; 关键词：帕金森病遗传多态性儿茶酚-O-甲基转移酶单胺氧化酶B

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谢淑

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