耳聋是影响人类健康和造成人类残疾的常见疾病,它是由遗传和环境因素共同作用引起的。遗传性耳聋包括综合征型耳聋和非综合征型耳聋,其中,线粒体12S r RNA基因突变与其甚是关系密切,位于12S r RNA解码区的A1555G、C1494T、961del T/ins C(n)等突变与氨基糖苷类抗生素耳毒性和非综合征型耳聋密切相关。A1555G和C1494T的致聋机理已得到确定:A1555G或C1494T突变在12S r RNA的A区形成一个新的结合碱基对,使12S r RNA的二级结构与细菌的1 6S r RNA更为相似,促进了氨基糖苷类抗生素与之结合,使得带该类突变的个体在使用氨基糖苷类抗生素后会发生听力缺失。通过对线粒体12S r RNA基因突变的研究,能够明确部分非综合征型耳聋的病因,从而为患者及其家族成员提供准确的遗传咨询和指导,为防聋治聋提供帮助。
目的对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA（mt DNA）A1555G位点条件进行优化。方法利用3＇硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mt DNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定最佳反应条件。结果分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳PCR条件：退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6μmol/L,检测模板浓度为103~106copies/μL。结论确定了分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据。
目的:改进传统重叠延伸PCR方法,实现引入3个不同DNA突变位点的简便的多位点定点突变。方法:根据前期构建的包含人线粒体12S rRNA(NC 01290)3个热点突变位点的野生型质粒序列,利用Muta Primer 2.0软件设计针对3个热点突变位点的3对互补的定点突变引物,以野生型质粒为模板,结合重叠延伸PCR反应和冷冻析出法,产生同时包含3个突变位点的突变目的片段,酶切后克隆到载体中,测序确证是否突变成功。结果:DNA测序证实3个不同突变位点同时成功引入,定点突变载体构建成功。结论:用改进的重叠延伸PCR技术能简便、高效地获得多位点定点突变载体,在分子生物学领域有较高的使用价值。
