陈素云
- 作品数：3 被引量：12H指数：3
- 供职机构：温州医学院检验医学院浙江省医学遗传学重点实验室更多>>
- 发文基金：病毒基因工程国家重点实验室开放课题基金浙江省重大科技专项基金浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白的真核表达及生物学活性检测被引量：4
- 2010年
- 本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后,用pAAV2neo-sTNFRII-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD;然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式;最后,收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD无血清悬浮培养24h后的培养上清,进行sTNFRII-gAD融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示,所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD质粒结构正确,sTNFRII-gAD序列与预期一致;分别用抗人肿瘤坏死因子受体II和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性;免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRII-gAD融合蛋白的表达,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明,sTNFRII-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。因此,本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。
- 陈素云何秋山董小岩吴小兵高基民
- 关键词：脂联素融合蛋白真核表达
- 双萤光素酶共表达载体构建及特性研究被引量：4
- 2010年
- 利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。
- 付昕阳王刚田文洪陈素云董小岩吴小兵谭万龙
- 关键词：共表达
- SA／hIL-15融合蛋白的制备及生物学活性鉴定被引量：4
- 2009年
- 目的制备链亲和素(SA)/人白细胞介素-15(hIL-15)融合蛋白SA-hIL15和hIL-15-SA,并鉴定其生物学活性。方法构建原核表达质粒pET24a-6His-SA-hIL-15和pET32a-hIL-15-SA-6His,转化大肠杆菌BL21(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性。CCK-8检测融合蛋白PHA刺激的人外周血淋巴细胞增殖的活性,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16.F10细胞锚定修饰率。结果成功构建了两种重组融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌实现了高效表达,目标蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%。经纯化、复性的SA/hIL-15融合蛋白具有双重活性,即:能促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的hIL-15活性,和SA介导的高效结合至表面已生物素化的B16.F10肿瘤细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%)。SA-hIL-15双功能融合蛋白促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖活性高于hIL-15-SA双功能融合蛋白。结论SA/hIL-15双功能融合蛋白的制备为hIL-15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下了基础。
- 苏华陈艳丽陈素云余宏盛文波胡志明高基民
- 关键词：白细胞介素-15链亲和素融合蛋白
