卢春
- 作品数：139 被引量：271H指数：8
- 供职机构：南京医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金霍英东青年教师基金江苏省高校自然科学研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学文化科学更多>>
- Notch1蛋白胞内段重组慢病毒载体的构建及其在原发性渗出性淋巴瘤细胞中的功能验证被引量：1
- 2018年
- 目的:构建含Notch1胞内段(intracellular Notch1,ICN)基因的重组慢病毒载体,并检测其对Notch信号通路以及卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)潜伏感染的原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞增殖能力的影响。方法:从真核表达质粒pIP-Flag-ICN中扩增出ICN基因片段,并将其插入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs Green(pHAGE)质粒中以构建重组质粒pHAGE-ICN。在人胚肾上皮细胞293T细胞中共转染重组质粒pHAGE-ICN、包装质粒psPAX2和包膜质粒p MD2.G,获得表达ICN的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。以ICN重组慢病毒感染PEL细胞系BCP-1细胞,通过蛋白质印迹法检测ICN以及Notch信号通路下游靶蛋白的表达,采用细胞计数法检测过表达ICN对BCP-1细胞增殖能力的影响。结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE-ICN构建成功。通过慢病毒三质粒包装系统成功包装携带ICN基因的重组慢病毒,并经梯度稀释法测得病毒滴度约为2×10~7TU/mL。以ICN重组慢病毒感染BCP-1细胞,蛋白质印迹证实ICN蛋白获得有效过表达,并且能够促进Notch信号通路下游靶蛋白Hes-1的表达。细胞计数结果显示,过表达ICN能显著增强BCP-1细胞的增殖能力。结论:成功构建了含ICN基因的重组慢病毒载体,重组慢病毒介导的ICN过表达能够增强Notch信号通路活性,并增强PEL细胞的增殖能力。
- 赵润然沈忱悠严沁卢春
- 关键词：慢病毒原发性渗出性淋巴瘤
- 逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究被引量：4
- 2004年
- 目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制. 方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI 和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果. 结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长. 结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.
- 蒋奎荣刘训良苗毅卢春戴存才徐泽宽钱祝银
- 关键词：逆转录病毒载体介导胰腺癌
- 人乳头瘤病毒E6蛋白通过上调氯离子蛋白通道5的表达促进宫颈癌细胞迁移被引量：4
- 2018年
- 目的:探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)E6蛋白与氯离子通道蛋白5(chloride voltage-gated channel 5,CLCN5)之间的关系以及CLCN5对宫颈癌细胞迁移的影响。方法:采用RNA干扰技术敲低HPV E6基因,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测敲低HPV E6后宫颈癌HeLa细胞中CLCN5 mRNA及蛋白的表达水平。通过PCR扩增CLCN5基因片段,并将其克隆至表达载体pCDNA3.1-3×Flag(简称pCDNA3.1)质粒中,构建重组质粒pCDNA3.1-CLCN5。将目的质粒pCDNA3.1-CLCN5及其对照pCDNA3.1质粒分别转染宫颈癌HeLa细胞,蛋白质印迹法检测CLCN5蛋白的表达。Transwell迁移实验检测过表达CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。同时,将CLCN5的小干扰RNA及其阴性对照分别转染宫颈癌HeLa细胞,Transwell迁移实验检测敲低CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。结果:RT-qPCR和蛋白质印迹检测结果显示,敲低HPV E6可显著降低CLCN5的mRNA和蛋白表达水平。质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pCDNA3.1-CLCN5构建成功。蛋白质印迹检测结果显示CLCN5蛋白在宫颈癌HeLa细胞中被有效过表达或敲低。Transwell迁移实验结果表明,过表达CLCN5可促进宫颈癌细胞的迁移,敲低CLCN5可抑制宫颈癌细胞的迁移。结论:HPV E6蛋白通过上调CLCN5的表达促进宫颈癌细胞迁移。
- 赵凯旋徐静云卢春
- 关键词：E6人乳头瘤病毒宫颈癌细胞迁移
- HHV-8 ORF50启动子区序列分离、鉴定及在293细胞中启动活性分析被引量：3
- 2003年
- 目的:分离和鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF50基因上游启动子区序列,评价其在293细胞中启动活性。方法:以佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增HHV-8 ORF50启动子区序列,克隆进pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因上游多克隆位点,分别构建含正反双向ORF50启动子重组报告质粒,并分别转染293细胞,作Lu-ciferase活性检测,计算相对Luciferase活性单位(RLU)。结果:①克隆的HHV-8 ORF50启动子区序列长655碱基(bp),含多个潜在推测AP1、SP1和ERE等转录因子结合序列;②ORF50启动子与正常pGL-3基本载体相比,其RLU增加了26.3倍;③TPA刺激后ORF50启动子与刺激前相比启动活性增加了4.1倍。结论:HHV-8 ORF50启动子区序列在293细胞中具有较强的启动活性;TPA可以作为一有效的阳性对照刺激物用于进一步鉴定ORF50启动子特性。
- 卢春黄丽曾怡徐亚林
- 关键词：人类疱疹病毒8型启动子活性
- 含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建被引量：2
- 2002年
- 目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。
- 朱建中卢春
- 关键词：绿色荧光蛋白人疱疹病毒8型
- 胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆被引量：1
- 2003年
- 目的:分离及克隆胰腺癌基因组中K-ras基因片段,构建重组反义K-ras癌基因逆转录病毒载体,并探讨其意义。方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHⅠ和EcoRⅠ位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1及侧翼序列,并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN-Z中,并经菌液PCR和限制性内切酸酶切鉴定。结果:K-ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN-Z中。结论:LZRSpBMN-Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K-ras目的基因外显子1方便可行,可用于重组反义K-ras癌基因逆转录病毒载体的构建。
- 蒋奎荣刘训良卢春苗毅戴存才徐泽宽曾怡黄丽
- 关键词：胰腺肿瘤反义克隆
- 谷氧还蛋白3的生物学功能及肿瘤相关性
- 2017年
- 谷氧还蛋白3（glutaredoxin 3，GLRX3）是由335 个氨基酸构成的Ⅱ型单巯基谷氧还蛋白，参与体内铁平衡、氧化还原反应与抗氧化性应激、细胞生长与抗凋亡等的调节，是控制细胞周期进程、抵御细胞氧化性应激的关键蛋白。GLRX3高表达于乳腺癌、小肠癌、肺癌、鼻咽癌等肿瘤细胞中，且与肿瘤的进展程度和预后相关，可作为肿瘤标志物，因而日益被重视。此文综述了GLRX3的结构、功能及其与肿瘤相关性、致瘤可能机制。
- 邱惠萍史红娟卢春姚水洪
- 关键词：氧化性应激肿瘤
- 重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探被引量：3
- 2010年
- 目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）病毒蛋白R（Vpr）的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤（PEL）细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR（RT-PCR）检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数（MOI）为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹（Western blot）技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子（Rta）mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.
- 贾雪梅王平秦娣卢春
- 关键词：慢病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒
- 开放读码框架50基因介导HIV-1感染相关的肝细胞生长因子诱导人类疱疹病毒8型复制被引量：3
- 2004年
- 目的 研究人类疱疹病毒 8型 (HHV 8)开放读码框架 (ORF) 5 0基因启动子在HIV 1感染相关细胞因子肝细胞生长因子 /驱散因子 (HGF/SF)诱导原发性渗出性淋巴瘤 (PEL)BC 3中潜伏感染的HHV 8复制过程中的作用。方法 将HGF/SF连续加入到体外培养的BC 3中 ,分别于培养第 3天和第 7天收集刺激细胞 ,电子显微镜观察成熟HHV 8病毒的形成 ;提取细胞总RNA ,North ernblot和定量聚合酶链反应 (PCR)法检查HHV 8次要衣壳蛋白ORF2 6mRNA转录。同时 ,将已构建的HHV 8ORF5 0启动子 +虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV 1Tat基因重组表达质粒分别共转染BC 3和人脐静脉血管内皮细胞 (HUVECs) ,转染后 2 4h加入HGF/SF和 /或重组HIV 1gp12 0刺激 ,刺激后 2 4h收集细胞 ,进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯 (TPA)刺激为阳性对照。结果 HGF/SF可以上调HHV 8ORF2 6mRNA表达 ,且于刺激的第 7天 ,ORF2 6mRNA表达上升了 4 .1倍 ,BC 3细胞中同时可观察到成熟的HHV 8病毒粒子 ;HGF/SF能够诱导ORF5 0启动子活性 ,但HIV 1Tat和 gp12 0蛋白与HGF/SF协同上调ORF5 0启动子活性的能力较弱。 结论 HIV 1感染相关细胞因子HGF/SF诱导HHV 8复制的过程至少有部分由ORF5 0启动子介导。
- 卢春曾怡钱超唐桂霞
- 关键词：肝细胞生长因子启动区
- CD/5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞的杀伤作用
- 2005年
- 采用分子克隆技术构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′ssarcoma-associatedherpesvirus,KSHV)转化基因K12和含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因重组逆转录病毒表达质粒,分别命名为LZRS-K12和pLXSN-Fcy∷Fur。将LZRS-K12质粒转染NIH3T3细胞系,诱导细胞转化获得具有肿瘤细胞生物学特性的N/K12细胞,进一步将pLXSN-Fcy∷Fur质粒转染N/K12细胞,获得含CD基因的N/K12/FF细胞。加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后,采用MTT法、流式细胞仪和免疫组化(IHC)等方法,分别检测细胞存活率、凋亡率及凋亡相关蛋白的表达。结果显示,N/K12/FF细胞在使用5-FC后存活率明显下降。流式细胞仪检测结果显示,5-FC作用后的N/K12/FF细胞的凋亡率与作用前相比增加了4.6%。与此同时,经5-FC作用后的N/K12和N/K12/FF细胞的生长周期发生了明显变化,均表现为G0-G1期细胞比率降低,S和G2-M期细胞比率增高。5-FC使得N/K12细胞的增殖主要阻滞在G2-M期,而N/K12/FF细胞的增殖主要阻滞在S期。IHC检测结果表明,N/K12细胞在5-FC使用前后Fas和Fas-L表达改变均不明显;而N/K12/FF细胞在5-FC使用后的Fas和Fas-L表达水平均明显高于5-FC使用前的水平。提示,CD/5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞具有杀伤作用;凋亡有可能介导了部分杀伤过程;Fas和Fas-L有可能部分参与凋亡的诱导。
- 唐桂霞卢春
- 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒CD/5-FC系统卡波济肉瘤杀伤作用
