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蓝氏贾第鞭毛虫沉默信息调节因子2重组蛋白复性方法比较被引量：3: 2012年; 目的采用3种不同复性方法获得具有生物活性的重组蛋白蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,Gl)沉默信息调节因子2(GlSir2),并比较3种方法的复性效率,为研究其活性和生物学功能奠定基础。方法表达并纯化GlSir2的包涵体,分别采用稀释复性、透析复性和柱上复性等3种方法对GlSir2包涵体进行复性,并通过检测复性蛋白的活性,比较3种复性方法的特点。结果蛋白活性回收以柱上复性较高,为1 712Flu,透析复性和稀释复性法分别为758Flu和206Flu。结论 3种复性方法均能获得有活性的融合蛋白GlSir2,其中以柱上复性方法处理的蛋白活性回收值最高。; 张霞巨红妹王云华李雅杰; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫包涵体复性

新型蛋白标签在分子生物学中的应用被引量：6: 2011年; 蛋白标签技术在细胞蛋白定位等基础研究中的应用已经极为日常化和普遍化。传统的融合蛋白标签在蛋白定位、转运、相互作用以及构象改变等研究中发挥重要作用。但是来自这类标签的信号不能随意开启,从而会妨碍一些蛋白表达、定位及降解的时间分辨研究。随着技术的不断进步,研究人员相继开发出了具有不同功能的新型蛋白标签。这些新型蛋白标签可为活细胞表面蛋白及细胞内蛋白成像、时间分辨标记、蛋白捕获及纯化、蛋白质定位及转运、活细胞内初期蛋白合成及复合体形成等蛋白动力学、脉冲追踪分析等方面的研究提供强有力的工具。; 巨红妹张霞王云华; 关键词：SNAP-TAG

蓝氏贾第鞭毛虫稳定表达载体的构建被引量：1: 2013年; 目的构建蓝氏贾第鞭毛虫基因的稳定表达载体。方法以本实验室构建的pGL gdh-Neo为基础,在gdh5′UTR端ApaⅠ酶切位点前插入蓝氏贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(tim)基因以方便载体与贾第虫基因组整合,得到pGLtim-gdh-Neo;设计含有16个酶切位点的多克隆位点区(MCS)并将其置于α2-Tubulin启动子调控下,使成为一个完整表达框,合成该表达框并单酶切插入重组质粒pGL tim-gdh-Neo的ApaⅠ位点,获得重组稳定表达质粒载体pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo。在MCS区插入Luc验证其有效性,以pTAL-Luc质粒为模板,扩增Luc基因序列,纯化后将其插入EcoRⅤ单酶切的pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo多克隆位点区,重组质粒线性化后转染虫体,并对G418筛选获得的Luc贾第虫重组株进行荧光素酶活性检测。结果构建了可稳定转染,带有多克隆位点区及Neo抗性基因的重组表达载体pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo,其长度为5 395bp;Luc重组质粒pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo可稳定转染至贾第虫并表达荧光素酶。结论成功构建了蓝氏贾第鞭毛虫稳定表达载体pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo。; 巨红妹郑国侠张霞王云华李雅杰; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶

沉默信息调节因子2与基因转录调控被引量：3: 2011年; 沉默信息调节因子2(silence information regulator 2,Sir2)家族是一类保守的去乙酰化酶蛋白家族,广泛存在于古细菌到哺乳动物的多种生物中,具有依赖NAD+的去乙酰化酶和ADP-核糖转移酶活性。Sir2在染色质沉默、基因调控、代谢调节和细胞寿命调节等众多生命活动中发挥着重要作用。它主要是通过去乙酰化酶活性以及与其他蛋白相互作用从而调节染色质结构、修饰转录相关因子,实现对基因转录的调节。本文重点对Sir2参与基因转录调控的研究进展作一综述。; 张霞巨红妹李雅杰; 关键词：去乙酰化酶染色质转录调控寄生虫

蓝氏贾第鞭毛虫基因快速标记载体的构建被引量：1: 2012年; 目的构建可快速标记蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)基因的重组载体。方法采用重叠PCR法将新霉素(Neo)基因置于gdh启动子调控下,并插入pGEM-5zf载体,获得带有Neo筛选标记的重组载体pGL gdh-Neo;并将基因合成所得3′末端带有3×HA标签的多克隆位点区克隆至重组载体pGL gdh-Neo,构建可快速标记贾第虫基因的重组载体pGLMCS-3HA-gdh-Neo。以该载体标记贾第虫H2A基因验证其可用性。PCR扩增组蛋白H2A基因序列,用EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切后克隆至重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo多克隆位点区。重组质粒线性化后转染虫体,并对G418筛选所获得的H2A贾第虫重组株进行基因组PCR、蛋白质印迹(Western blotting)和免疫荧光分析。结果构建了带有多克隆位点区和3×HA标签的可快速标记贾第虫基因的重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo,其长度为4 260 bp;H2A重组质粒稳定转染至贾第虫滋养体并正确整合至其基因组,可表达相对分子质量(Mr)为16 900的H2A(含3×HA标签)。结论构建了可快速标记贾第虫基因的重组载体pGL MCS-3HA-gdh-Neo。; 巨红妹王乙惠张霞王云华李雅杰; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫

蓝氏贾第鞭毛虫中国株组蛋白H2A基因的克隆与重组表达被引量：8: 2011年; 目的获取蓝氏贾第鞭毛虫中国株GlH2A基因及重组蛋白。方法 PCR扩增获取GlH2A基因,连接至pMD-19T并进行测序分析。连接至pET28a构建表达载体,并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),然后进行异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达。表达产物进行亲和层析纯化,再用Western blotting进行免疫学鉴定。结果序列测定获得蓝氏贾第鞭毛虫中国株GlH2A基因的编码序列,与美国WB株H2A(GL50803_14256,Accession:NW_001844132)序列完全一致。该基因编码124个氨基酸,预测分子量13900Mr,保留了与核小体形成相关的重要氨基酸位点,在大肠埃希菌中获得表达,纯化后纯度达90%以上。Western blotting检测表明重组蛋白能够被抗His6标签抗体识别。结论克隆得到GlH2A基因编码序列;得到了重组GlH2A蛋白,并进行了纯化,为进一步研究组蛋白及其修饰酶在基因转录调控中的作用奠定了基础。; 王云华郑国侠巨红妹张霞李雅杰; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫克隆

蓝氏贾第鞭毛虫GlSir2的NAD依赖的去乙酰化酶活性初步研究: 沉默信息调节因子2(Silence information regulator 2,Sir2)是首先在酵母中发现的一类依赖烟酰胺二核糖核苷(NAD)的去乙酰化酶,广泛存在于从古细菌到哺乳动物多种生物体内,具有高度的同源性...; 张霞王云华李雅杰; 文献传递

蓝氏贾第鞭毛虫沉默信息调节因子2(Sir2)基因的克隆、表达与纯化被引量：2: 2011年; 目的获取蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,Gl)沉默信息调节因子2(Sir2)基因序列及其重组蛋白。方法以蓝氏贾第鞭毛虫中国C2克隆株基因组DNA为模板,PCR扩增GlSir2基因编码序列,将所得片段连接至pMD-19T质粒。转化大肠埃希菌(E.coli)JM109,挑取阳性克隆进行测序。将GlSir2基因插入原核表达载体pET28b,构建表达载体pET28b-GlSir2,转化E.coli BL21(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况。收集重组表达产物,用8 mol/L尿素溶解包涵体并收集上清,镍离子亲和层析进行纯化。将纯化产物透析复性,蛋白质印迹(Western blotting)进行免疫学鉴定。结果获得了蓝氏贾第鞭毛虫中国C2克隆株GlSir2基因编码序列,该序列包含一个1 680 bp的开放阅读框架,可编码559个氨基酸,预测其蛋白的相对分子质量(Mr)约为62 800。构建表达载体pET28b-GlSir2,经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达。溶解包涵体并经纯化后的目的蛋白纯度达80%以上,经透析复性后获得可溶蛋白。Western blotting分析显示,该重组蛋白可被His标签抗体识别。结论克隆了蓝氏贾第鞭毛虫GlSir2基因编码序列,并获得重组表达,重组蛋白可被His标签抗体识别。; 张霞巨红妹王云华李雅杰; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫克隆纯化

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张霞

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