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中国强毒钩端螺旋体膜蛋白基因的真核表达及基因免疫被引量：1: 2002年; 目的　检测含有强毒赖型钩体OmpL1外膜蛋白基因的 2个重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1在哺乳动物细胞中的表达 ,及其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法　采用脂质体转染法 ,以重组质粒转染COS7细胞 ,通过抗性标志筛选稳定转染入质粒的细胞 ,RT PCR和Westernblot检测被转染细胞OmpL1基因的表达情况。然后 ,将重组质粒以肌注法免疫BALB c小鼠 ,每 2周 1次 ,共 3次 ,ELISA检测小鼠的体液免疫应答水平。结果　RT PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ;Westernblot检测显示 ,重组质粒转染组总蛋白样品在相对分子质量 (Mr)为 33.5× 10 3 处出现特异的蛋白带 ,而空质粒载体转染组均没有此相应的DNA或蛋白质条带。两质粒第 2次免疫小鼠 2周后 ,10 0 μg重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1DNA免疫组产生了效价为 1 196 83的高滴度抗体 ,注射 5 0 μgpcDNA3 OmpL1+5 0 μgpcDNA3的小鼠产生滴度为 1 6 5 6 1较高的抗体 ,第 3次免疫 2周后 ,抗体水平下降。结论　两重组质粒者均能在体外培养的哺乳动物细胞中表达钩体OmpL1蛋白质 ,以其免疫小鼠后 ,均诱导产生高滴度的特异性抗体 ,其效价与全钩体疫苗相当。; 晏菊芳鲍朗胡昌华李学敏张会东; 关键词：膜蛋白基因钩端螺旋体 DNA疫苗特异性抗体

钩端螺旋体赖型017株外膜脂蛋白LipL41基因的克隆及原核表达被引量：2: 2001年; 目的　构建钩端螺旋体外膜脂蛋白 L ip L41基因的重组原核表达质粒 ,为进一步制备以 L ip L41为目的基因的亚单位疫苗提供实验依据。方法　根据钩端螺旋体 L.kirscneri RM5 2株外膜脂蛋白 L ip L41基因序列设计引物 ,以赖型钩端螺旋体 0 17株基因组 DNA为模板 ,进行 PCR扩增并 DNA测序 ,以质粒 p GEX1λT为载体 ,插入 L ip L41基因片段构建重组原核表达质粒 ,并检测 L ip L41的表达。结果　测序结果示所得片段为 L ip L41的编码序列 ,酶切及 PCR分析证实重组质粒构建成功 ,SDS- PAGE和 Western blotting分析重组质粒可高效表达蛋白质 L ip L41。结论　 L ip L41基因的重组原核表达质粒构建成功。; 李学敏鲍朗胡昌华谢勇恩晏菊芳张会东; 关键词：基因克隆基因表达膜脂蛋白

赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因结构比较性研究被引量：5: 2000年; 用 PCR方法扩增不同毒力赖型钩体 Omp L1基因片段 ,进行序列测定 ,用相关软件比较分析核苷酸序列、蛋白质二级结构以及限制性内切酶谱 .不同毒力赖型钩体均能扩增出960 bp的片段 ,非致病 Patoc株未能扩出相应片段 ,中国赖型参考株 Omp L1序列 ( Gene BankNo.AF2 50 31 8)与流感伤寒型相应序列比较有 98个核苷酸差异 ,同源性为 89.8% ,二级结构预测和氨基酸疏水图显示变异主要发生在跨膜蛋白的膜外区 ,其膜上成分并未明显变化 ;赖型强弱毒力株之间 Omp L1序列仅 8个核苷酸差异 ,6个氨基酸变异 ,且集中在 C末端 2 92 -30 5位氨基酸之间 ;限制性内切酶谱分析显示赖型 Omp L1基因位点发生特异变化 .结果提示 ,外膜蛋白 Omp L1基因是钩体保守性较强的致病标记 ;赖型钩体减毒致弱可能与 Omp; 胡昌华鲍朗晏菊芳李学敏张万江张会东; 关键词：赖型钩端螺旋体外膜蛋白蛋白质二级结构

利用抑制消减杂交技术研究钩端螺旋体致病相关基因被引量：16: 2001年; 目的　利用抑制消减杂交技术 (SSH) ,比较致病与非致病钩端螺旋体 (简称钩体 )之间基因组差异 ,筛选致病钩体特有的基因片段。方法　以赖型 0 1 7株为tester,非致病性patocⅠ株为driv er,选择合适的四碱基内切酶将基因组酶切 ,连接特殊设计的adaptor进行消减杂交和PCR ,得到消减混合物 ,与T/A克隆载体连接 ,转化JM1 0 9建立差异消减文库 ,经PCR和Southernblot筛选鉴定阳性克隆 ,进而对部分片段进行测序和同源分析。结果　AluⅠ适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段 ;经SSH筛选鉴定得到 3 0个片段大小为 2 0 0～ 1 3 0 0bp的阳性克隆 ,部分已测序的片段中 1个与硫胺素合成蛋白高度同源 ,4个与GenBank无明显同源性 ,可能为赖型致病钩体所特有而非致病钩体缺失的基因片段 ,已被GenBank收录 ,收录号分别为AF3 0 0 873～ 3 0 0 877。结论　SSH是一种有效、灵敏、高特异的比较分析基因组差异的方法 ,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义。; 鲍朗胡昌华李学敏晏菊芳张万江张会东; 关键词：钩端螺旋体抑制消减杂交

赖型钩端螺旋体外膜蛋白真核表达载体构建及表达的初步研究: 2002年; 目的　测定所克隆的强毒力赖型钩端螺旋体OmpL1基因的序列 ,构建能够在哺乳动物细胞中表达赖型钩体OmpL1外膜蛋白的重组质粒。方法　首先对自行构建的含有赖型钩端螺旋体OmpL1基因的重粗质粒 pAC -OmpL1进行插入片段的序列分析 ,然后将该质粒略作修改 ,使更适于在真核细胞中表达目的蛋白 ,同时将OmpL1基因亚克隆入另一个质粒pcDNA3中 ,采用限制性内切酶分析所得质粒的正确性。最后以脂质体转染法将两个重组质粒转入COS7细胞 ,以RT -PCR分析导入质粒的表达。结果　pAC -OmpL1中插入的赖型钩体OmpL1基因全长 96 0bp ,具有完整的阅读框架 ,与流感伤寒型钩体OmpL1基因同源性达 88%。限制性内切酶分析显示 ,质粒pAC -OmpL1的修改已达目的 ,OmpL1基因也按正向插入到pcDNA3中。RT -PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ,而空白质粒载体组无此条带。结论　赖型钩端螺旋体OmpL1基因与流感伤寒型的高度同源 ,该基因已成功地插入到两个真核表达质粒载体中。; 晏菊芳鲍朗胡昌华李学敏张会东; 关键词：真核细胞基因序列钩体病

莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达: 2001年; 目的　为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法　采用 377型 DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒 p BX1的插入片段进行 DNA序列测定 ,并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒 p BX1在大肠杆菌中进行诱导表达 ,并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果　1重组质粒 p BX1插入片段大小为 477bp,其核苷酸序列与文献报道的 p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异 ,2成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱 ;3重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了 2 9kd的融合蛋白 ;4Western- blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论　该研究成功地对莱姆病螺旋体 83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达 ,为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。; 谢勇恩鲍朗胡昌华李学敏陈炜华; 关键词：莱姆病螺旋体重组质粒 DNA序列分析大肠杆菌

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李学敏

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