刘子
- 作品数：27 被引量：112H指数：6
- 供职机构：军事医学科学院野战输血研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金军队医药卫生科研基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 大肠杆菌肠毒素ST_(1b)基因的亚克隆及其核苷酸序列分析被引量：3
- 1994年
- 以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。
- 冯书章刘晓明刘子李丰生张瑜红黄培堂
- 关键词：基因克隆大肠杆菌
- 大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1/K99/LacZ基因重组的研究被引量：1
- 1997年
- 将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。
- 冯书章许崇波黄培堂刘子张喻虹刘晓明李丰生孟锐奇姚湘燕朱平
- 关键词：大肠杆菌基因重组
- 大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究被引量：15
- 1996年
- 对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明。
- 许崇波冯书章刘子黄培堂刘晓明
- 关键词：融合蛋白免疫原性
- 绿脓杆菌外毒素A的纯化被引量：4
- 1996年
- 用绿脓杆菌ＰＡ１０３株接种于ＴＳＡ甘油培养基３２℃培养，产生绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ），经流水透析除盐、ＤＥ－５２纤维素阶段洗脱、硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５除盐、ＤＥ－５２纤维素梯度洗脱、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００分子筛层析，纯化了绿脓杆菌外毒素Ａ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，纯化后的毒素为单一蛋白带，分子量约６６０００；对普通小鼠ＬＤ５０为０．２４μｇ蛋白。用ＰＥＡ抗血清作免疫印迹分析，进一步证实纯化的蛋白为ＰＥＡ，毒素约纯化了５００倍，总蛋白回收率约０．０２４％，毒素回收率约１１％。
- 刘晓明朱平刘子马从林
- 关键词：绿脓杆菌外毒素A纯化
- 抗E．coli RecA单克隆抗体的制备与鉴定
- 1995年
- 本研究用纯化Ｅ．ｃｏｌｉＲｅｃＡ蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Ｓｐ２／０融合，以粗制Ｅ．ｃｏｌｉＲｅｃＡ包被酶标反应板，间接ＥＬＩＳＡ方法筛选阳性孔，经有限稀释法４次克隆化，建立了两株分泌抗ＲｅｃＡ蛋白ＭｃＡｂ的细胞系２Ｄ６和３Ｂ１。免疫印迹表明ＭｃＡｂ只对细菌的ＲｅｃＡ有反应，不与细菌其它成分发生反应。间接ＥＬＩＳＡ进一步表明，ＭｃＡｂ２Ｄ６、３Ｄ１只对细菌ＲｅｃＡ类蛋白有反应，不与小鼠肝、心、肺、脾等和ＢＨＫ细胞的内外蛋白反应。
- 刘晓明马从林刘子朱平
- 关键词：大肠杆菌单克隆抗体
- 谷胱甘肽过氧化物抗体酶ScFv的基因构建
- 1998年
- 特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株５Ｃ９所分泌的ＭｃＡｂ经化学修饰后，其抗体酶活性比兔肝谷胱甘肽过氧化物酶活性高２．６倍。在所建成的杂交瘤细胞株基础上，通过提取该细胞总ＲＮＡ，分离ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，以及ＶＨ和ＶＬ基因的ＰＣＲ扩增、组装，成功地构建了谷胱甘肽过氧化物抗体酶ＳｃＦｖ基因。电泳分析证明，ＶＨ和ＶＬ基因长度分别为３４０ｂｐ和３２５ｂｐ；所构建的ＳｃＦｖ基因长度约为７５０ｂｐ，并带有ＳｆｉⅠ和ＮｏｔⅠ切点，可用于ＳｃＦｖ的基因重组及其表达。
- 冯书章刘子郭学军张国利吴广谋罗贵民高姝娟
- 关键词：谷胱甘肽过氧化物酶抗体酶基因构建
- 大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究被引量：24
- 1997年
- 用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。
- 许崇波卫广森冯书章刘子刘晓明刘子岳军明
- 关键词：融合基因基因克隆免疫原性
- 绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达被引量：9
- 1997年
- 为防治绿脓杆菌感染造成的细胞坏死及多器官衰竭，本试验克隆了含绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）结合亚单位（Ⅰ区）和部分跨膜亚单位（Ⅱ区）编码３０９个氨基酸的约１０００ｂｐ的基因片段，以正确阅读框架将该片段置于原核高效表达Ｔ７启动子下游，构建了高效表达质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ。转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭ１７４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ后，经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，均表达了外源目的基因蛋白，其中ＢＬ２１（ＤＥ３）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ的表达量明显高于其他宿主菌。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，外源蛋白分子量约３４０００，与ＰＥＡⅠ区和部分Ⅱ区基因所编码的蛋白理论估计值相符，命名为ＰＥ３４。凝胶薄层扫描显示，ＰＥ３４含量占菌体蛋白总量的５６％。
- 郭学军刘晓明朱平刘子孟锐奇马丛林冯书章
- 关键词：绿脓杆菌外毒素克隆
- 具有谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力的抗体酶研究──单克隆抗体的制备及化学诱变被引量：2
- 1996年
- 将２，４－二硝基氯苯（ＤＮＣＢ）专一地与底物谷胱甘肽（ＧＳＨ）巯基反应，合成了半抗原ＧＳＨ－Ｓ－ＤＮＰ；通过蛋白质连接技术（戊二醛法）将此半抗原偶联到牛血清白蛋白（ＢＳＡ）上，制备出全抗原。用吸收光谱测得每个ＢＳＡ分子上平均连接３３个半抗原。用全抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过淋巴细胞杂交瘤技术，制备出抗ＧＳＨ的单克隆抗体杂交瘤细胞系４Ａ４、６Ａ６、１Ｃ８和４Ｇ３等。将其中的４Ａ４培养上清经５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀、ＤＥＡＥ－５２纤维素离子交换柱层析和ＢｉｏｇｅｌＰ－２００凝胶过滤分离得到４Ａ４ＩｇＧ抗体，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检验纯度大于９０％。４Ａ４ＩｇＧ可变区中的丝氨酸（Ｓｅｒ）经苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）活化，再用硒化氢（Ｈ２Ｓｅ）处理，则Ｓｅｒ转变成硒代半胱氨酸（ＳｅＣｙｓ），使４Ａ４ＩｇＧ引入该催化基因。化学诱变后的４Ａ４ＩｇＧ具有谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＰＸ）活性，其活力是世界上最好的ＧＰＸ模拟物ＰＺ５１的１１００倍，是游离ＳｅＣｙｓ的２．２×１０４倍，已达到天然酶活力的数量级水平。经初步应用，该抗体酶可防止自由基对心肌线粒体的损伤。
- 刘子朱振奇丁兰冯书章罗贵民杨同书沈家骢
- 关键词：单克隆抗体化学诱变谷胱甘肽过氧化物酶
- 绿脓杆菌外毒素ArecA基因的融合及融合蛋白的表达被引量：1
- 1997年
- 将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析。
- 刘晓明朱平刘子马从林冯书章
- 关键词：绿脓杆菌外毒素ARECA基因融合融合蛋白
