刘景华
- 作品数：19 被引量：29H指数：3
- 供职机构：中国食品药品检定研究院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学矿业工程更多>>
- 狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析被引量：1
- 2013年
- 对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。
- 李加曹守春石磊泰吴小红刘景华王云鹏唐建蓉俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒全基因组
- 狂犬病不同毒株的生物学特性研究
- 目的 研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法 以小鼠脑内和肌肉途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位(Plaque-formi...
- 汤重发俞永新刘景华曹守春石磊泰李加吴小红王云鹏李玉华
- 关键词：狂犬病病毒细胞病变
- 狂犬病病毒减毒株CTN-181毒力减弱的分子基础研究被引量：2
- 2013年
- 目的了解CTN-181弱毒株的全长基因结构及其毒力减弱的分子基础。方法将CTN-181的全长基因进行测序并与4株减毒疫苗株和5株街毒株进行全序列基因比对,与CTN-181株的母株CTN-1进行不同区段蛋白基因中的替换位点比较。结果全长基因比较显示,CTN-181株与其他9株狂犬病病毒的核苷酸和氨基酸同源性为81.4%～93.3%和86%～97%。与CTN-1母株比较,CTN-181株存在12处核苷酸和7处氨基酸突变,氨基酸突变位点发生在N157(N→S),M187(Q→P),G276(L→V),G333(R→Q),G336(N→D),G389(E→K)和L1061(S→N)。结论 CTN-181存在7处氨基酸突变,可以认为是其毒力减弱的分子基础,其中在G蛋白内的4个位点的氨基酸突变最为重要。
- 石磊泰张晓焕俞永新刘景华曹守春李加吴小红董关木
- 关键词：全基因组序列毒力相关基因
- 狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究被引量：8
- 2014年
- 目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位（plaque-forming unit,PFU）和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度（CCID50）,并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法（direct immunofluorescent assay,dFA）做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 （PFU和CCID50）测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。
- 汤重发俞永新刘景华曹守春石磊泰李加吴小红王云鹏董关木李玉华
- 关键词：狂犬病病毒细胞病变
- 狂犬病病毒核蛋白及糖蛋白在杆状病毒表达系统中的共表达及鉴定
- 2013年
- 目的利用杆状病毒表达系统共表达狂犬病病毒CTN-1V株核蛋白（nucleoprotein，NP）及糖蛋白（glycoprotein，GP）。方法RT-PCR分别扩增CTN．1V株病毒GP、NP编码区基因，分别依次克隆入转移质粒pFastBacDual的PⅢ区及P，。区构建杆状病毒重组转移质粒P—NG，转化DHl0BacE．coli感受态细胞获得重组穿梭质粒A-NG，转染Sf9细胞获得重组杆状病毒Bac-NG，高效表达目的蛋白NP、GP，进行Westernblot分析。结果重组杆状病毒穿梭质粒A-NG经PCR鉴定证明构建正确；狂犬病病毒NP、GP在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中获得正确表达，表达的重组蛋白NP、GP相对分子质量（Mr）约为51x10^3、59x10^-；表达的重组蛋白NP、GP均可与抗RV小鼠血清特异性结合。结论成功共表达狂犬病病毒CTN-1V株NP、GP，表达产物具有良好的抗原性，为狂犬病病毒基因工程疫苗及诊断试剂的研究奠定了基础。
- 李加曹守春石磊泰吴小红刘景华王云鹏邹剑俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒核蛋白糖蛋白杆状病毒表达系统
- 稳定表达狂犬病病毒CTN-1V株糖蛋白细胞系的建立被引量：1
- 2013年
- 目的构建能稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的CHO细胞系。方法用RT—PCR法扩增和分离CTN-1V株狂犬病毒糖蛋白基因，测序后克隆入pCDNA5．0FRT载体，构建重组质粒pCDNA5．0FRT—G，之后与POG44质粒共转染CHO细胞，采用潮霉素B抗性筛选，挑选阳性克隆，间接免疫荧光和WesternBlot进行稳定表达细胞系的鉴定。结果经酶切和测序鉴定，获得重组表达质粒pCDNA5．0FRT—G，共转染CHO细胞后，获得肉眼可见阳性细胞克隆，刮取阳性克隆进行传代扩大培养并定义为第2代，经过10代后免疫荧光和WesternBlot结果依然阳性。结论成功建立稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的CHO细胞系，为深入研究糖蛋白的功能奠定基础。
- 曹守春李玉华李加唐建蓉石磊泰刘景华王云鹏俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白类细胞系
- 狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性的初步研究
- 2012年
- 目的构建狂犬病病毒糖蛋白基因DNA真核表达质粒，并检测其免疫原性。方法用RT—PCR法扩增和分离CTN株狂犬病病毒糖蛋白基因，测序后克隆至pcDNA5．0载体，构建重组质粒pcDNA5．0-G，提取质粒，转化293T细胞，检测糖蛋白瞬时表达，并以该重组质粒肌肉注射免疫BALB／c小鼠，狂犬病病毒CVS株攻击，观察小鼠存活情况。结果酶切、测序结果显示重组质粒pcDNA5．0-G构建成功，瞬时表达结果显示糖蛋白获得大量表达。经肌肉注射质粒常规免疫小鼠，病毒攻击后小鼠保护率为73．3％，对照组为6．7％。结论所构建狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒pcDNA5．0-G经肌肉注射免疫后可有效保护小鼠免受狂犬病病毒攻击，具有良好的免疫原性，这为后期核酸疫苗的研发奠定基础。
- 王云鹏曹守春李加刘景华石磊泰李玉华董关木
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白免疫原性
- 我国狂犬病疫苗生产毒株不同代次G基因和毒力稳定性研究
- 目的：分别测定6代次CTN-1V、aG株及3代次PV2061株病毒糖蛋白基因序列,并研究3株病毒致病力稳定性。方法：RT-PCR方法扩增各代次病毒糖蛋白基因组序列,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定并拼接序列,应用...
- 李加曹守春石磊泰王云鹏吴小红刘景华董关木李玉华俞永新
- 关键词：狂犬病病毒毒力测定
- 文献传递
- 狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析被引量：1
- 2013年
- 目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。
- 李加曹守春石磊泰王云鹏吴小红刘景华唐建蓉俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白生物信息学
- 狂犬病病毒CTN-1V株糖蛋白遗传稳定性研究分析被引量：2
- 2013年
- 目的测定6代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列，并研究其致病力稳定性。方法RT-PCR方法扩增6代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列，分别将产物克隆入pGEM-T载体中，测定并拼接序列，应用DNAStar和Mega4．0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析，并与近期我国分离且具有地域代表性的狂犬病病毒街毒株进行基因同源性分析；测定6代次CTN-1V株病毒滴度（LD卯／m1）和细胞荧光滴度（FFU／m1），采用FFU／LD∞指标来对病毒的毒力进行评价。结果6代次CTN-1V株病毒序列测定结果表明，仅第1222位的G突变为A，导致408位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸，而1320位核苷酸由A突变为G，但显示为无义突变；5代次CTN-1V株病毒致病力指标均在1．00～1．07之间；糖蛋白生物信息学分析表明，CTN-1V株病毒与我国近期分离的街毒株均具有较高同源性。结论CTN-1V株病毒糖蛋白传代稳定，且与我国近期分离的街毒株高度同源，各代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列的测定及致病力研究，为完善该毒株的质量控制提供数据支持。
- 李加曹守春石磊泰王云鹏吴小红刘景华唐建蓉俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白致病力生物信息学分析
