本研究旨在对绵羊NYD-SP 27基因进行克隆和原核表达,并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中绵羊NYD-SP 27基因序列(登录号:KX905090)设计1对特异性引物,通过PCR方法扩增目的基因片段,构建pET-22b(+)-NYDSP27重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提质粒进行双酶切鉴定,将鉴定正确的pET-22b(+)-NYDSP27重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并利用生物信息学方法对NYD-SP 27基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1617 bp的NYD-SP 27基因片段,并经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切获得大小为5400和1617 bp的两条片段,表明成功构建了pET-22b(+)-NYDSP27重组质粒,诱导表达重组蛋白大小约60 ku,主要以包涵体的形式存在。NYD-SP27蛋白分子式为C 2798 H 4319 N 737 O 819 S 19,原子总数为6892,理论等电点(pI)为6.16,为酸性蛋白,不稳定系数为46.96,属于不稳定蛋白,总平均亲水性为-0.403。该蛋白无跨膜结构,无信号肽,含有45个潜在的磷酸化位点和24个抗原表位;NYD-SP27蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占26.21%、3.90%、18.03%和51.86%。本试验结果可为深入研究绵羊NYD-SP27蛋白的作用机理提供理论依据。
应用绵羊精子提取物体外激活绵羊体细胞核移植胚和山羊-绵羊异种核移植胚,比较了不同浓度的绵羊精子提取物对绵羊同种和异种重构胚的激活作用,并与传统的化学激活方法对重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数做了比较。结果表明,绵羊精子提取物可以有效地激活绵羊体细胞核移植胚和山羊-绵羊异种核移植胚,每一重构胚注射3 pL浓度为5 mg/mL的绵羊精子提取物,对同种和异种胚的发育效果均为最好,并显著高于其他试验组(P<0.05)。注射绵羊精子提取物对绵羊-山羊异种核移植胚的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响,与离子霉素联合6-DAMP激活法差异不显著(P>0.05)。注射绵羊精子提取物对绵羊同种核移植胚的卵裂率和囊胚率的影响,与离子霉素联合6-DAMP激活法差异也不显著(P>0.05),但精子提取物注射法的绵羊核移植胚的囊胚细胞数显著(P<0.05)高于化学激活法的细胞数(72.4 vs 65.2)。
