高宇辉
- 作品数：13 被引量：9H指数：1
- 供职机构：中国医学科学院基础医学研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究被引量：1
- 2017年
- 为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶108;疫苗佐剂组产生的特异性Ig G抗体以Ig G1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。
- 杨丽雪邓唯唯高宇辉王恒
- 关键词：纳米乳佐剂恶性疟原虫免疫原性
- 活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究被引量：1
- 2016年
- 目的采用活体电穿孔免疫方法,研究恶性疟原虫DNA核酸疫苗不同免疫剂量对于动物免疫反应的影响,并对载体中Cp G寡脱氧核苷酸基序的免疫刺激活性进行了初步探讨。方法将恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1基因克隆于真核表达载体VR1012中,使用电穿孔导入方法免疫小鼠,采用ELISA检测抗体效价、ELISPOT测定细胞因子分泌水平,探索基因疫苗最佳免疫剂量以及考察免疫反应类型。使用计算机分析恶性疟核酸疫苗中特殊CpG基序组成,实验验证基因疫苗中CpG基序的免疫刺激活性。结果相同DNA免疫剂量下,电穿孔免疫法与单纯肌内注射免疫法相比较,小鼠血清IgG抗体效价提高118倍,且能显著诱导体内特异性Th1和Th2型细胞反应。电穿孔免疫小鼠血清可识别天然虫体抗原,抗体效价可达1∶1200。恶性疟原虫核酸疫苗抗原DNA含有24个CpG免疫活性基序,可以有效的刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖与IL-6分泌。结论活体电穿孔方法可以显著提高恶性疟原虫DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平。
- 高宇辉邓唯唯张佳佳李月
- 关键词：DNA疫苗电穿孔CPG基序
- 恶性疟原虫多表位人工随机重组疫苗M.RCAg-1的中试规模制备与鉴定被引量：1
- 2014年
- 中试规模高效制备恶性疟原虫多表位人工随机重组疫苗M.RCAg-1,并对其免疫原性进行鉴定。20 L培养基规模发酵培养M.RCAg-1的工程菌,产物经高压匀浆破碎后,通过镍琼脂糖凝胶FF层析和琼葡糖凝胶G200HP层析两步分离纯化获得中试M.RCAg-1。将15只BALB/c小鼠随机地平均分为3组(弗氏佐剂组、中试M.RCAg-1与弗氏佐剂配伍组和小试M.RCAg-1与弗氏佐剂配伍组)进行皮下免疫,利用间接Elisa和间接免疫荧光(IFA)技术对3次免疫后小鼠血清中的特异性抗体进行分析。IPTG诱导4 h后发酵结束,菌体产量25 g/L,M.RCAg-1约占菌体总蛋白的24%;经两步柱层析分离纯化后,目的蛋白纯度大于95%,回收率高达53.2%;与弗氏佐剂对照组相比,中试M.RCAg-1和小试M.RCAg-1都能在小鼠体内诱生高水平的特异性抗体应答,其抗体滴度均可达到1∶1 024 000。与此同时,两实验组鼠血清抗体的对疟原虫天然抗原都有识别,其识别水平并无差异(P>0.05)。本研究成功地高效制备出多表位人工随机重组疫苗M.RCAg-1,并在小鼠体内证实其具有良好的免疫原性,为随后进行的M.RCAg-1的临床前研究奠定基础。
- 刘新韦新桂高宇辉王恒
- 关键词：恶性疟原虫蛋白疫苗免疫原性
- 阿仑膦酸钠作为口服佐剂对恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1免疫原性的影响被引量：1
- 2017年
- 目的评价口服阿仑膦酸钠(alendronate,ALD)对恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1免疫原性的影响。方法分别用不同剂量的ALD(0.05、0.1、1 mg)和M.RCAg-1配伍后免疫BALB/c小鼠,M.RCAg-1蛋白经背部皮下注射免疫,20μg/只,同时经灌胃给药ALD,共免疫3次,每次间隔14 d,于末次免疫后10 d经小鼠尾静脉采血,分离血清。ELISA法测定小鼠血清中抗M.RCAg-1蛋白的抗体滴度、IgG抗体分型及血清抗体对M.RCAg-1单表位的识别滴度;间接免疫荧光反应(IFA)检测小鼠血清抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别滴度;ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫水平。结果 0.05 mg ALD+M.RCAg-1及0.1 mg ALD+M.RCAg-1组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平均可达1∶10~8;IgG抗体主要以IgG1为主;对M.RCAg-1的11个单个抗原表位(E1~E11)可全部识别;由各表位抗原(除E2外)诱导分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数明显高于分泌IFNγ的特异性淋巴细胞克隆数(P<0.0001)。0.1 mg ALD+M.RCAg-1组小鼠血清抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别滴度明显高于0.05 mg ALD+M.RCAg-1组(P<0.000 1)。结论 ALD作为恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1的佐剂可显著提高其体液免疫及细胞免疫水平。
- 张佳佳邓唯唯高宇辉王恒
- 关键词：阿仑膦酸钠恶性疟原虫免疫原性
- 人源miR-185通过靶向恶性疟原虫var基因减弱感染红细胞粘附作用的研究
- 2016年
- 为了探讨人源miR-185对恶性疟原虫vor（pfl1955w）基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响，体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7，构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒，再分别利用Lipofectamine2000转染293T细胞和Cytomix电转恶性疟原虫3D7，流式细胞仪检测转染效率，用双荧光素酶报告验证人源miR-185对var（pfll955w）的dbl区域直接调控作用，Q-PCR检测vat（胡1955w）mRNA的表达，细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附。结果显示，293T细胞和3D7的转染效率在50％以上，过表达人源miR-185可显著抑制含vat（pfll955w）dbl的荧光素酶基因的表达；在293T细胞和3D7中，人源miR-185能够减少var（pfl1955w）mRNA的含量，并使感染红细胞粘附作用下降了39％。结果表明，人源miR-185对疟原虫var（pfll955w）基因表达有下调作用，进而影响恶性疟原虫的粘附。
- 赵志鹏王振生高宇辉邓唯唯魏春燕王恒
- 关键词：恶性疟原虫MICRORNAS粘附作用
- 伯氏疟原虫pbmag-1基因片段克隆及原核表达优化
- 2007年
- 目的克隆并表达伯氏疟原虫pbmag-1基因cDNA片段。方法在GenBank中检索伯氏疟原虫编码基因pbmag-1部分cDNA序列,设计特异引物,经RT-PCR从伯氏疟原虫ANKA株扩增出该基因的部分cDNA片段。以锚定OligodT引物反转录mRNA获得的cDNA为模板,利用已知序列设计特异引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术延伸pbmag-13′端未知的编码序列,并将其克隆于原核表达载体后转入大肠埃希菌(E.coli)BL21-(DE3)-RIL株,经优化诱导条件,表达了重组蛋白PbMAg-1并用其免疫小鼠。结果获得1341bp具有完整3′末端序列的pbmag-1基因片段,其A/T含量为73%。以包涵体形式表达的重组蛋白免疫小鼠,其血清抗体经蛋白质印迹(Western blotting)分析,能特异性地识别伯氏疟原虫感染红细胞相对分子质量约为Mr64000的蛋白。结论获得重组蛋白PbMAg-1的3′端完整的pbmag-1基因cDNA片段,为研究伯氏疟原虫PbMAg-1蛋白在鼠疟免疫反应中的作用奠定了实验基础。
- 高宇辉王恒
- 关键词：伯氏疟原虫基因克隆原核表达
- 恶性疟原虫候选抗原PfMAg-1的免疫保护效果评价
- 疟疾是目前世界上对人类危害最严重三大传染病之一，它是由蚊媒传播的寄生原虫病，主要流行于热带和亚热带地区。全世界每年有5亿人受到疟原虫感染，约三百万人死于恶性疟疾。其中80％是五岁以下的儿童和孕妇。疟原虫是疟疾的病原体，寄...
- 高宇辉
- 关键词：恶性疟原虫基因疫苗免疫保护性生物学功能
- 文献传递
- 原核表达及一步法制备可溶性白喉毒素突变体CRM197被引量：1
- 2018年
- 目的构建一种新型的重组蛋白大肠杆菌胞内自动切割表达系统表达可溶性的CRM197重组蛋白,实现一步法纯化。方法将CRM197编码序列与硫氧还蛋白(Trx)序列融合并克隆于原核表达载体p ET-32a(+)载体上,Trx与CRM197之间加入HRV3C(人鼻病毒3C)蛋白酶识别区序列和组氨酸纯化标签编码序列,HRV3C蛋白酶基因克隆于原核表达质粒p GArasd,共同转化大肠杆菌Origami B(DE3),15℃温和诱导,并使用Ni-NTA基质亲和纯化CRM197重组蛋白。结果 CRM197融合蛋白表达后,随即被伴随表达的HRV3C蛋白酶水解释放出游离的带His标签的CRM197重组蛋白,经过一步法亲和纯化,得到纯度约95%的CRM197样品。与DNA共同孵育,显示所获CRM197重组蛋白具有脱氧核糖核酸酶活性。结论通过构建新型的双质粒自动切割原核表达系统,简化了在大肠杆菌表达纯化可溶性CRM197重组蛋白的工艺,降低了制备成本。
- 高宇辉邓唯唯
- 关键词：可溶性表达纯化
- 短寡核苷酸链高效转染体外培养恶性疟原虫的研究
- 2013年
- 5%山梨醇连续2次同步化恶性疟原虫培养物(8 h窗口),培养16 h后,直接孵育组(A组)将50μl含寡核苷酸培养基与450μl恶性疟原虫培养物(5%虫血率,1%血压积)混合孵育,Entranster-R试剂转染组(B组)将50μl转染复合物(含寡核苷酸链和转染试剂)与450μl恶性疟原虫培养物混合孵育,培养5 h后重悬,分别取出250μl,1 500×g离心3 min,收集沉淀,进行荧光显微镜观察和流式细胞术检测转染效率。剩余细胞经RPMI 1640培养基洗涤1次后,加入500μl含2%新鲜红细胞的培养基,继续培养12 h至第2个细胞周期,再次进行流式细胞术检测。荧光显微镜观察结果显示,Entranster-R试剂转染组可明显观察到感染红细胞中标记探针的绿色荧光,而直接孵育组未观察到绿色荧光。流式细胞术检测结果表明,Entranster-R试剂转染组小分子寡核苷酸转染疟原虫的效率可达(47.40±3.39)%,高于普通孵育法[(0.60±0.27)%],且该组在第2个周期中维持转染率约(26.85±2.90)%,而直接孵育组在第2个细胞周期则几乎检测不到。提示利用纳米转染试剂Entranster-R能提高寡核苷酸转染疟原虫的效率。
- 周洪昌高宇辉邵圣文张慧张婷
- 关键词：恶性疟原虫
- 体外短期培养可提高伯氏疟原虫成熟裂殖体获得率被引量：1
- 2013年
- 在观察了正常状态下ICR小鼠体内伯氏疟原虫PbANKA1596cll发育特征的基础上，从采血状态、培养环境及时间等多方面优化伯氏疟原虫PbANKA1596c11（Pb1596）体外培养方法，增加成熟裂殖体比例，为提高转染效率打下良好基础。当小鼠体内原虫率达到5％～15％时，经梯度离心富集滋养体期感染红细胞，再用0．01L小体积完全培养基、缩短培养时间至8～10h体外培养，观察成熟裂殖体的生长状态及比例。结果表明，与传统方法相比，优化后的体外培养方法在保证细胞90．27％的高存活率同时，有效增加成熟裂殖体的比例从0．97％上升至24．37％（P〈0．05），且单个裂殖体平均裂殖子数由13增加至16（P〈0．05），缩短实验周期至11—13h，并可避免游离裂殖子的流失，从而为进一步的鼠疟转染实验奠定良好基础。
- 贾晶王振生高宇辉刘娟王恒
- 关键词：伯氏疟原虫体外培养转染
