刘芳
- 作品数：14 被引量：29H指数：4
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- 铜绿假单胞菌的LexA蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化
- 2007年
- 目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白LexA进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化。方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的LexA基因,将此基因片段插入到表达载体pET32 a(+)上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。包涵体洗涤后用8 mol/L尿素溶解,以镍离子亲合柱层析作为第1步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第2步精细纯化,反相高相液相色谱法(HPLC)测定蛋白的浓度。结果:LexA以包涵体形式表达,表达量为45%,经镍离子亲合柱层析纯化后LexA蛋白纯度达到85%以上,回收率大于80%,镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析两步纯化目的蛋白,经HPLC测定,最终目的蛋白的纯度为98.97%。结论:在pET32 a(+)表达系统中实现了PA的LexA蛋白的高效表达,两步纯化法获得高纯度的目的蛋白,为进一步鉴定LexA靶位点奠定了基础。
- 陈炫沙建平汤绍辉唐晖查庆兵刘芳
- 关键词：铜绿假单胞菌LEXA纯化
- 健康青年人HCMV特异性CD8^+T细胞频率和表型分析
- 2007年
- 目的利用负载pp65495-503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型。方法以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪对样品进行三色荧光分析。结果健康中国青年人外周血中存在高频率的pp65495-503特异性CD8+T细胞,占CD8+T细胞的百分率为0.14~6.84%(均数2.45%);表型分析显示其CD28+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为为32.5%(±21.7%)和58.58%(±10.4%)(P<0.001);CD57+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为55.8%(±18.4%)和27.4%(±8.3%)(P<0.001)。同时,对三例健康青年人CD8+T细胞上多种表面分子的详细分析显示,pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞有不同比率的细胞表达CD62L、CD45RO、CD38和CD27,而且还有一定比例的细胞表达CD45RA,但不表达活化抗原CD69分子。结论青年中国人外周血中存在高频率的HCMV特异性CD8+T细胞,这些细胞的表型存在高度异质性,可能是处于不同分化阶段的记忆和效应细胞群体组成。
- 查庆兵徐丽慧刘芳孙荭贾仟涛李丰耀何贤辉
- 关键词：人巨细胞病毒流式细胞术
- 凝胶阻滞试验分析铜绿假单胞菌LexA蛋白与其靶位点的特异性结合
- 2008年
- 目的:分析铜绿假单胞菌(pseudom onas aeruginosa,PA)的LexA与其靶位点的特异性结合的特性。方法:以PCR法扩增PA的LexA基因,将其克隆于原核表达载体pET-22b(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用镍离子亲合柱层析和Superdex-75凝胶过滤层析分离和纯化目的蛋白,以含推定LexA结合位点的片段CTGTN27ACAG为探针,用凝胶阻滞试验检测LexA蛋白与探针序列结合的能力及特异性。结果:构建了pET22b-LexA重组质粒,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%,获得纯度大于95%的目的蛋白;CTGTN27ACAG能与LexA蛋白发生特异性结合。结论:推定LexA结合位点CTGTN27ACAG能与PA的LexA蛋白特异性结合,可能是LexA蛋白的结合靶位点。
- 陈炫汤绍辉唐晖查庆兵刘芳
- 关键词：铜绿假单胞菌结合位点
- 益活清胰Ⅰ号对重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织缺血的影响被引量：3
- 2006年
- 目的观察大鼠重症急性胰腺炎(SAP)时血浆内皮素1(ET1)、血管性假血友病因子(vWF)、6酮前列腺素E1a(6ketoPGE1a)、血栓素B2(TXB2),血小板最大聚集率,胰腺血流量的变化,以及益活清胰Ⅰ号的干预作用。方法81只SD大鼠随机分为假手术组(A组)和SAP模型组(B组),益活清胰Ⅰ号治疗组(C组),每组27只。LSⅢ型组织血流仪检测胰腺的血流量,放免法检测血浆ET1、血清TXB2及6ketoPGE1a含量,酶联免疫吸附法测定血浆vWF含量,全自动血小板聚集仪检测胶原和花生四烯酸诱导的血小板最大聚集率。结果B组大鼠各时点胰组织血流量较A组下降2～5倍(P<0.05),C组各时点胰组织血流量较B组明显改善(P<0.05)。B组大鼠各时点的PAGm和血浆vWF、ET1、TXB2、6ketoPGE1a含量均较A组显著升高(P<0.05),C组大鼠各时点的PAGm和vWF、ET1、TXB2水平均显著低于B组(P<0.05),C组各时点6ketoPGE1a高于B组(P<0.05)。结论益活清胰Ⅰ号具有抑制二十碳烯酸类异常代谢,保护血管内皮细胞,抑制血小板活化和改善微循环的作用。
- 陈炫沙建平赵艳胡蓉冯本华邓翠东刘芳
- 关键词：重症急性胰腺炎内皮素-1血管性假血友病因子
- 铜绿假单胞菌LexA蛋白的纯化及免疫活性分析被引量：3
- 2007年
- 目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的LexA蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法:lexA基因片段插入表达载体pET32a(+),在E.coliBL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8mol/L尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的LexA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗LexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western blot分析LexA的免疫活性。结果:LexA以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的LexA具有良好的免疫活性。
- 陈炫汤绍辉唐晖查庆兵刘芳
- 关键词：铜绿假单胞菌LEXA纯化免疫活性
- DC-SIGN蛋白在家蚕系统中的表达及生物活性研究
- 2009年
- 目的:构建人DC-SIGN基因片段的家蚕表达系统,进行目的产物表达、鉴定及生物活性分析。方法:从体外刺激分化的DC细胞中克隆出DC-SIGNcDNA,在家蚕表达载体pBacPAK8的BamHⅠ和EcoRⅠ位点构建成重组质粒pBacPAK8-DC-SIGN,与线性化的Bm-BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,空斑筛选得到重组病毒Bm-BacPAK-DC-SIGN,重组病毒感染家蚕细胞BmN,Westernblot检测表达产物;HIV-1包膜糖蛋白gp120与表达产物孵育检测其生物活性。结果:构建了稳定表达人DC-SIGN蛋白片段的家蚕杆状病毒表达系统;成功表达了DC-SIGN蛋白片段,且能特异性地与HIV-1包膜糖蛋白gp120结合。结论:成功地在家蚕杆状病毒表达系统中表达了人DC-SIGN蛋白片段,具有天然DC-SIGN蛋白样的生物活性,为其抗体制备及AIDS防治药物的研发奠定了基础。
- 唐晖汤绍辉杨冬华吕正兵余威张耀洲周天鸿陈炫刘芳肖昕
- 关键词：HIVDC-SIGN蛋白表达生物活性分析
- 甲基丙二酸尿症一家系删CHC基因突变分析被引量：4
- 2009年
- 目的研究甲基丙二酸尿症（methymalonic aciduria，MMA）MMACHC基因的突变。方法应用聚合酶链反应及DNA直接测序技术对甲基丙二酸尿症一家系进行MMACHC基因突变位点检测，并与50名健康人的MMACHC基因进行对照。结果患者及其父亲的MMACHC基因中检测到一个新的整码突变，MMACHC基因第2外显子146154缺失CCTTCCTGG，导致P．49_51位缺失丙氨酸苯丙氨酸亮氨酸（AFL），50名对照者的等位基因无此突变。结论MMACHC基因的146_154缺失CCTTCCTGG也可能是该家系引起甲基丙二酸尿症的病因。
- 唐晖郝虎汤绍辉陈炫刘芳查庆兵李月琴李弘剑孙亮余明肖昕周天鸿
- 关键词：甲基丙二酸尿症基因突变
- 益活清胰Ⅰ号对大鼠重症急性胰腺炎心肌损伤的保护作用被引量：6
- 2006年
- 目的研究益活清胰Ⅰ号对重症急性胰腺炎(thesevereacutepancreatitis,SAP)大鼠心肌损伤的保护作用,探讨其作用的机制。方法63只SD大鼠随机分为治疗组(n=27)、SAP模型对照组(n=27)和假手术组(n=9),SAP模型采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立。ELISA法检测血清CTn1、CK-MB水平,免疫组化法检测心肌组织NF-κB的表达,光镜及电镜下观察胰腺及心肌组织的病理变化。结果大鼠SAP造模术后6h开始出现CTn1、CK-MB水平升高,治疗组各时点CTn1、CK-MB水平较对照组明显下降(P<0.01)。SAP大鼠各时间点均可见心肌组织NF-κB明显活化,治疗组各时间点NF-κB活化与对照组相比明显减弱(P<0.01)。光镜及电镜下可见SAP大鼠的心肌组织存在明显的变性、坏死等病理损伤,治疗组胰腺及心肌组织病理损伤明显减轻。结论益活清胰Ⅰ号能抑制NF-κB在心肌组织中的活化,减轻SAP大鼠心肌的损伤,对SAP合并心脏损害的具有保护作用。
- 陈炫沙建平赵艳胡蓉冯本华刘芳
- 关键词：重症急性胰腺炎心肌损伤核因子-ΚB
- 铜绿假单胞菌SOS反应阻遏蛋白LexA的复性及活性研究
- 2007年
- 目的:对LexA蛋白复性方法进行优化,对复性后的LexA蛋白的生物学活性进行分析。方法:采用含有GSH/GSSG的缓冲液,一步稀释法对变性LexA蛋白进行复性,用镍离子亲合柱及阳离子柱层析法对复性后的LexA蛋白进行纯化,再以Sephadex G-25凝胶柱脱盐,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和RP-HPLC法检测复性效果,Western blot分析复性前后及经DTT处理后的LexA蛋白的免疫反应性,凝胶滞留电泳试验检测复性LexA蛋白与DNA的特异性结合能力。结果:复性后的LexA蛋白出现单体和多聚体的形式,多聚体是由单条肽链聚合而成。LexA单体和多聚体与兔抗LexA多克隆抗体均有较好的反应性。复性后的LexA蛋白能与SOS盒序列发生特异性结合。
- 陈炫汤绍辉查庆兵唐晖刘芳
- 关键词：铜绿假单胞菌LEXA复性
- 血管内皮损伤在实验性重症急性胰腺炎发病中的作用被引量：7
- 2007年
- 目的观察SAP大鼠血循环中的血管内皮功能损伤标志物ET-1、vWF,血小板最大聚集率及胰腺血流量的变化,探讨血管内皮功能损伤在SAP发病中的作用。方法72只SD大鼠随机分为假手术组(A组,n=36)和SAP模型组(B组,n=36),SAP模型组采用5%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立。LS-Ⅲ型组织血流仪检测胰腺的血流量,放免法检测血浆ET-1含量,ELISA法测定血浆vWF含量,全自动血小板聚集仪检测二磷酸腺苷、肾上腺素、胶原和花生四烯酸诱导的血小板最大聚集率,并在光镜及电镜下观察胰腺病理变化及超微结构。结果诱发SAP后B组大鼠各时间点胰组织血流量较A组显著下降(P<0.01),6、12和18hB组胰组织血流量呈逐渐下降趋势。B组术后各时间点血浆ET-1、vWF含量较A组明显升高(P<0.01)。B组术后各时间点由二磷酸腺苷、肾上腺素、胶原和花生四烯酸诱导的血小板最大聚集率较A组显著升高(P<0.01)。B组胰腺出血坏死严重,微血管见大量微血栓,内皮细胞内有大量空泡形成。结论大鼠SAP早期存在血管内皮的损伤,血小板激活及胰腺缺血,血管内皮的损伤、血小板激活及微血栓形成导致的胰腺缺血可能在SAP的发病中起重要作用。
- 陈炫沙建平汤绍辉唐晖查庆兵刘芳
- 关键词：重症急性胰腺炎胰腺缺血内皮素-1血管性假血友病因子
