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HBx基因的真核表达及其对肝癌细胞系HepG2细胞表型的影响: 2012年; 目的为了探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系,构建HBV X基因(hep-atitis B virus X gene,HBx)真核表达载体及其肝癌(HCC)细胞系HepG2瞬转模型,并检测HBx对HepG2细胞表型的影响。方法以pCMV-HBx为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pcDNA3.1-Flag真核表达载体中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx,转染至HepG2细胞;Western印迹法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;5-溴尿苷(5-溴脱氧尿嘧啶核苷,5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)标记法检测转染HBx后细胞DNA合成变化;细胞周期检测试剂盒(CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit)检测转染HBx后细胞周期的变化;AnnexinⅤ-APC/7-AAD法检测转染HBx后细胞凋亡情况。结果重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该载体的HepG2细胞可检测到HBx蛋白的表达;与转染空质粒pcDNA3.1-Flag的细胞相比,细胞增殖能力增强,而细胞凋亡比率下降。结论成功构建了HBx基因真核表达载体,并研究了HBx对细胞表型的影响,为进一步探索HBx参与HBV引发HCC的分子机制奠定了基础。; 刘玉玲林巍然郭英飞杨冬姜颖; 关键词：HBX 肝癌真核细胞

bumetanide在抑制肝癌细胞转移中的应用: 本发明公开了一种bumetanide在抑制肝癌转移中的应用。布美他尼(bumetanide)可用于制备抑制肝癌细胞增殖和/或侵袭和/或转移的药物，制备治疗肝癌的药物，制备降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白含量的产品。布美...; 姜颖贺福初周亚亚孙薇林巍然魏汉东; 文献传递

bumetanide在抑制肝癌细胞转移中的应用: 本发明公开了一种bumetanide在抑制肝癌转移中的应用。布美他尼(bumetanide)可用于制备抑制肝癌细胞增殖和/或侵袭和/或转移的药物，制备治疗肝癌的药物，制备降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白含量的产品。布美...; 姜颖贺福初周亚亚孙薇林巍然魏汉东; 文献传递

鉴定血管加压素受体(V1aR)在小鼠肝脏枯否细胞和巨噬细胞中的表达被引量：3: 2013年; 为了研究V1aR在肝脏枯否细胞和巨噬细胞RAW264.7中的表达,为今后研究V1aR表达与巨噬细胞功能间的关系奠定基础,本研究首先使用胶原酶灌注法和磁珠分选法(MACS)分离纯化小鼠肝脏枯否细胞;然后分别使用普通显微镜、透射电镜和流式细胞仪对分离纯化后枯否细胞的纯度与功能进行评估;最后使用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、Western blot和免疫荧光检测V1aR在肝脏枯否细胞和巨噬细胞RAW264.7中的表达。普通显微镜和透射电镜结果表明本研究分离纯化后的桮否细胞具有巨噬样细胞的形态特征和吞噬活性;且流式细胞仪结果表明本研究分离纯化的枯否细胞的纯度可以达到98%以上。RT-PCR和Western blot结果表明在mRNA和蛋白质水平均能检测到V1aR在枯否细胞和巨噬细胞RAW264.7中的表达。同时免疫荧光实验进一步验证了V1aR在巨噬细胞RAW264.7中的表达。总之,本研究首次鉴定到了血管加压素受体V1aR在巨噬样细胞中的表达。; 陈华海孙龙钦林巍然贺福初张明姜颖; 关键词：血管加压素肝脏枯否细胞巨噬细胞

急性肝损伤过程中肝内不同来源巨噬细胞的作用研究被引量：3: 2014年; 目的急性肝损伤过程中,肝脏内存在来源不同的两类巨噬细胞即肝脏固有巨噬细胞和单核细胞源性巨噬细胞。该研究明确这两类巨噬细胞在急性肝损伤过程中的作用。方法采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)构建急性肝损伤小鼠模型,通过流式细胞术分析注射CCl4后24、48、72 h时小鼠肝内巨噬细胞表面抗原(CD45,F4/80,Ly6C和CD11b)的表达情况,分选出肝脏固有巨噬细胞(CD45+F4/80hi)和单核细胞源性巨噬细胞(CD45+F4/80lo),并应用qRT-PCR检测两群巨噬细胞中细胞因子的表达情况。结果与正常对照相比,注射CCl4后24、48、72 h时小鼠肝内总F4/80+细胞数显著增加,尤其是72 h时;24 h CD45+F4/80lo细胞数显著增加。急性肝损伤过程中,与正常对照相比,F4/80hi巨噬细胞和F4/80lo巨噬细胞中MCP-1、TNF-α、TGF-β1、基质金属蛋白酶(MMP)-12和MMP-13mRNA水平均显著升高,IL-12β和IL-6 mRNA水平只在F4/80hi巨噬细胞中显著升高,MMP-9 mRNA水平只在F4/80lo巨噬细胞中显著升高。与F4/80lo巨噬细胞相比,F4/80hi巨噬细胞中MCP-1和MMP-12 mRNA水平显著升高,TNF-αmRNA水平显著降低。结论急性肝损伤时,肝内固有巨噬细胞和单核细胞源性巨噬细胞均表达炎性细胞因子,促进炎症反应,导致肝损伤;肝内固有巨噬细胞募集炎性单核细胞的能力和表达炎性细胞因子(IL-12β,IL-6)、MMP-12的能力强于单核细胞源性巨噬细胞;单核细胞源性巨噬细胞表达炎性细胞因子(TNF-α)和MMP-9的能力强于固有巨噬细胞。; 陈芳艳郝运伟林巍然范旭姜颖贺福初; 关键词：急性肝损伤

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响: 2014年; 目的:构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法:以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGEEF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果:经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制(P<0.01),S期细胞分布比例明显降低(P<0.01)。结论:RAB27A基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。; 刘雪杰林巍然唐立春孙薇魏汉东姜颖; 关键词：慢病毒肝细胞癌细胞增殖

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林巍然

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