沈永才
- 作品数：7 被引量：11H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院野战输血研究所更多>>
- 相关领域：生物学化学工程医药卫生更多>>
- 人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析被引量：2
- 2003年
- 目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。
- 贾莉玮吕茂民徐斯日古愣沈永才赵保全章金刚
- 关键词：CDNA突变体克隆定点突变
- 人蛋白CcDNA基因的克隆及序列分析被引量：3
- 2003年
- 为实现人蛋白CcDNA在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性 ,针对人蛋白CcDNA序列设计引物 ,运用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)从人胎肝总RNA中钓取人蛋白CcDNA ,将其克隆入 pIRESneo载体中 ,通过酶切和PCR鉴定出重组体并进行测序分析。结果表明 ,获得大小为 1386bp的人蛋白CcDNA基因 ,成功构建人蛋白CcDNA载体 pIRES/hPC ,为进一步进行人蛋白CcDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。
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- 关键词：CDNA基因克隆逆转录聚合酶链反应
- 人蛋白C转基因小鼠的建立及乳腺表达
- 2005年
- 目的为了获得乳腺定位表达人蛋白C(hPC)的转基因动物。方法采用分步克隆的方法,构建大鼠乳清酸蛋白(WAP)启动子调控的人蛋白C质粒,命名为pWPC。将该质粒系统鉴定后,用PvuⅠ+SmaⅠ双酶切,回收4·6kb的片段(WAP-hPC-PolyA)。通过显微注射技术,将其注入昆明小鼠受精卵雄原核内;共注受精卵810枚,存活640枚,移植给28只假孕母鼠,怀孕的18只母鼠共产仔81只。结果提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测,34只阳性,再经Southernblot检测,其中20只整合阳性;将7只整合阳性母鼠传代,产仔7日后收集乳汁,进行ELISA检测,结果均有表达。结论已成功建立了人蛋白C转基因鼠乳腺生物反应器,为hPC乳腺表达研究奠定了基础。
- 赵宝全章金刚董朝辉贾莉玮沈永才吕茂民姚站馨李伟静孙曼霁
- 关键词：转基因小鼠乳腺生物反应器乳清酸蛋白
- 重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定被引量：1
- 2005年
- 目的获得转染人蛋白CcDNA的工程细胞株,实现重组蛋白C的表达。方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,浓缩后进行鉴定。结果经G418筛选得到了21株克隆化细胞,SDS-PAGE和Westernblot鉴定表明,表达产物含有人蛋白C,且具有抗凝活性。结论在哺乳动物细胞中已成功表达重组人蛋白C,为进一步深入研究及产业化奠定了基础。
- 贾莉玮吕茂民徐斯日古楞沈永才于群张亚东章金刚
- 关键词：抗凝活性
- 重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定
- 目的在克隆蛋白C cDNA的基础上进行其在哺乳动物细胞中的表达。方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC,用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经CA18加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清...
- 贾莉玮吕茂民徐斯日古楞沈永才于群张亚东章金刚
- 文献传递
- 重组人蛋白C的研究进展被引量：3
- 2002年
- 人蛋白C具有抗凝、促纤维蛋白溶解和潜在的抗炎作用,本文在简要介绍了人蛋白C的结构、功能的基础上,重点对哺乳动物细胞和转基因动物表达重组人蛋白C的研究进展作了综述。
- 沈永才章金刚倪道明裴雪涛
- 关键词：基因重组转基因动物
- 人血浆蛋白C的纯化与鉴定被引量：4
- 2004年
- 目的 建立人血浆蛋白C的纯化与鉴定方法。方法 利用DEAE SephadexA 5 0代替氯化钡 ,对血浆进行预处理 ,再经DEAE SepharoseFF离子交换和肝素 SepharoseCL 6B亲和层析进行分离纯化 ,用活化的部分凝血活酶时间 (APTT)测定组分活性 ,非还原型SDS PAGE测定其相对分子质量 ,Westernblot鉴定其特异性。结果获得相对分子质量为 6 2 0 0 0的蛋白条带 ,此条带可与人蛋白C单克隆抗体发生特异性反应。结论 已成功地从血浆中分离到蛋白C ,为其规模化生产奠定了基础。
- 沈永才孙文种孙文种吕茂民章金刚裴雪涛
- 关键词：纯化
