魏玉英
- 作品数：17 被引量：18H指数：2
- 供职机构：第四军医大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金“重大新药创制”科技重大专项更多>>
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- 截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定
- 2011年
- 目的构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定。方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR I及Xho I酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定。结果重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白。结论成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础。
- 李海涛宋朝君孙元杰魏玉英李永明刘飞刘志佳张葵金伯泉杨琨
- 关键词：GST融合蛋白蛋白表达
- CIITA对MHC-Ⅱ基因的表达调控及其应用被引量：2
- 2008年
- MHC-Ⅱ在适应性免疫应答及T细胞的选择活化过程中具有重要作用。MHC-Ⅱ反式激活蛋白(CⅡTA)是调控其表达的关键分子。CⅡTA可协调多种转录因子与MHC-Ⅱ基因启动子作用,调控过程中还涉及到表观遗传学修饰及染色质重组,这些研究在基因疫苗设计、肿瘤治疗等方面都有着积极的意义。
- 魏玉英杨琨
- 关键词：CIITA表观遗传学疫苗
- 以肿瘤抗原BAP31为靶点的基因疫苗构建及其诱导小鼠免疫反应的研究被引量：3
- 2009年
- 目的:构建重组表达载体P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗并接种小鼠,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法:利用分子克隆技术,构建重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31,同时构建P-BAP31/EGFP和P-L-BAP31/EGFP重组质粒,并将其以脂质体瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31免疫C57BL/6小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;通过酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测免疫脾细胞在受到BAP31抗原刺激后产生IFN-γ和IL-4细胞因子的频率;通过乳酸脱氢酶(LDH释放)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答。结果:酶切及测序结果表明,成功构建了针对BAP31肿瘤抗原的P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗。通过荧光显微镜观察重组质粒转染的HeLa细胞,可见EGFP报告基因表达的绿色荧光。ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价发现,带LAMP组明显高于不带LAMP组(P<0.05),且两者均高于空质粒(P-LAMP)及正常对照(N)组(P<0.01)。ELISPOT检测脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率,带LAMP组与其他组相比显著提高(P<0.01)。LDH释放试验显示,带LAMP组的特异性CTL活性高于不带LAMP组,且均高于对照组(P<0.01)。结论:构建了针对肿瘤抗原BAP31的全长基因疫苗,以其免疫C57BL/6小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫反应,其中,P-L-BAP31基因疫苗各项免疫反应均优于P-BAP31。
- 宋朝君孙元杰魏玉英张赟欧阳清陈琨金伯泉杨琨
- 关键词：基因疫苗ELISPOT
- 可溶型CD96 ELISA检测系统的建立及其初步应用
- 研究背景:CD96是1992年基因克隆成功的属于IgSF的分子,胞膜外区含有3个免疫球蛋白样结构域,其中包括2个V样区和1个C2样区。膜型CD96分子主要表达于活化后的T细胞和NK细胞,参与NK细胞的杀伤功能。鉴于许多膜...
- 龚玖瑜朱参胜庄然宋朝军李琦徐竹蔚杨琨魏玉英杨安钢陈丽华金伯泉
- 文献传递
- 抗肿瘤基因疫苗载体的构建及抑瘤活性研究
- 目的：构建可表达具有强免疫源性，且可同时诱导体液免疫和细胞免疫的复合肿瘤抗原的基因疫苗载体，使其具有较强的抑瘤活性.意义：基因疫苗可以诱导、调控免疫应答且简单多样，给多种疾病，尤其是恶性肿瘤的治疗带来希望.肿瘤特异性抗体...
- 魏玉英孙元杰李海涛龚玖瑜张贇金伯泉杨安钢宋朝君杨琨
- 关键词：基因疫苗恶性肿瘤LAMP
- 抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备被引量：1
- 2013年
- 目的构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定。方法设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb)FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化。采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析。结果成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸。PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功。转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白。经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90%以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性。结论成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体。
- 孙元杰李永明张葵魏玉英宋朝君周幸春金伯泉杨琨
- 关键词：单链抗体WESTERNBLOT
- VEGFR2D3．4/GST融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定
- 目的:构建人血管内皮细胞生长因子Ⅱ型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2D3.4/GST的原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白。
- 魏玉英宋朝君孙元杰龚玖瑜金伯泉杨安钢杨琨
- 文献传递
- VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的:构建人血管内皮细胞生长因子II型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:由公司合成VEG-FR2胞膜外区第三、第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游,构建重组表达载体pGEX4T-VEGFR2 D3.4,将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白,经不同浓度尿素洗脱纯化后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果:SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量(Mr)为46 000,与理论值相符,主要以包含体形式存在;灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6%,纯化产物纯度最高为87.1%,Western blot证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。结论:利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。
- 魏玉英宋朝君孙元杰龚玖瑜金伯泉杨安钢杨琨
- 关键词：VEGFR2GST融合蛋白原核表达纯化
- 肿瘤疫苗的作用机制及研究进展
- @@一直以来，对于肿瘤的治疗多采用手术.放疗和化疗三大常规方法.一百多年前，caley用细菌疫苗免疫机体时，观察到肿瘤缩小。此后人们认识到肿瘤可以诱发免疫反应，而机体免疫系统对肿瘤也具有监视作用。肿摘疫苗的产生正是基于这...
- 欧阳清魏玉英金伯泉杨琨
- 关键词：肿瘤肿瘤免疫
- 文献传递
- 实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脾脏和肝脏中NKT细胞调变的研究被引量：1
- 2009年
- 目的:观察NKT细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脾脏和肝脏中所占百分比的变化特点,探讨NKT细胞在EAE模型中的免疫调节作用。方法:以MOG35-5521肽诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型并进行临床评分。于发病高峰期处死小鼠,分离脾脏和肝脏淋巴细胞,采用免疫荧光染色和流式细胞术(FCM)分析,观察EAE小鼠与正常小鼠脾脏和肝脏中NKT细胞在全部淋巴细胞中所占百分率的变化。结果:在EAE小鼠不同器官中,NKT细胞占淋巴细胞的百分率均较正常小鼠减少。脾脏NKT细胞百分率(%)从正常组2.22±0.14下降到EAE模型组1.94±0.07(P<0.05),肝脏NKT细胞百分率(%)从正常组5.52±2.17下降到2.67±1.41(P<0.05)。结论:NKT细胞在EAE模型C57BL/6小鼠脾脏和肝脏中增殖受抑,提示EAE发病可能通过对NKT细胞数量的调节进而影响其对免疫应答的调节。
- 欧阳清陈琨王曦张春梅郭俊魏玉英孙元杰徐竹蔚杨琨
- 关键词：NKT细胞EAE免疫调节
