任娜
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
- 供职机构：第二军医大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划上海市科学技术发展基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 人内皮-单核活化多肽-2的重组表达及其活性鉴定
- 2008年
- 目的:采用原核表达系统重组表达抗肿瘤细胞因子——人内皮-单核活化多肽2(endothelail monocyte-activating polypeptideⅡ,EMAP-Ⅱ),并探讨重组EMAP-Ⅱ的抗肿瘤生物学活性。方法:采用pMAL-p2x表达系统和BL-21菌株克隆表达人EMAP-Ⅱ_(147-312),对表达产物进行纯化。以发光底物法测定重组EMAP-Ⅱ介导人脐静脉内皮细胞ECV-304产生组织因子的活性;以流式细胞术测定其增强ECV-304细胞对于TNFα致凋亡的敏感性;以MTF法检测定其对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制效果。结果:测序证实EMAP-Ⅱ编码序列被正确克隆进表达载体,经诱导表达、纯化,获得重组EMAP-Ⅱ产物,每克菌体(湿重)可获得约500μg的重组蛋白,纯度为电泳纯。重组EMAP-Ⅱ在体外培养条件下可使ECV-304细胞产生TF因子;并可增强ECV-304细胞对于TNFα介导凋亡的敏感性,使凋亡率明显增加[(16.6±2.5)% vs(25.6±2.3)%,P<0.01];在一定的质量浓度(1μg/ml)下,EMAP-Ⅱ对SW1990细胞的增殖有一定抑制作用(P<0.05)。结论:本研究采用原核表达系统pMAL-p2x可表达高纯度的重组EMAP-Ⅱ,该因子具有良好的抗肿瘤生物学活性。
- 高云王梁华任娜孙铭娟郭爱云焦炳华
- 关键词：克隆表达抗肿瘤增殖抑制
- 以MMP酶切位点为连接臂构建Vasostatin和TRAIL的融合蛋白及其生物学活性分析被引量：2
- 2008年
- 以基质金属蛋白酶(MMP)酶切位点(PLGLWA)为连接臂,采用重组PCR技术获得血管形成抑制素(vasostatin,V)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL,T)的融合蛋白质编码序列,将该融合编码序列插入原核表达载体pMAL-c2中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,分别得到MBP-VT和MBP-TV融合蛋白,Amylose Resin亲和层析柱纯化.初步纯化的融合蛋白MBP-VT在体外内皮细胞增殖抑制实验、肿瘤细胞凋亡诱导实验中显示了明显的活性,而MBP-TV的作用不明显;体外酶切实验和培养肿瘤细胞上清酶切融合蛋白的免疫印迹分析,证实融合蛋白MBP-VT皆能被正确酶切.上述结果表明成功表达了融合蛋白VT,该融合蛋白具有双重抗肿瘤活性,并可在肿瘤高表达的MMP作用下裂解为V和T.
- 郭爱云王梁华孙铭娟焦豫良任娜焦炳华
- 关键词：TRAIL
- Tumstatin_(183-230)-TRAIL融合蛋白的克隆表达及其生物学双功能鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的:克隆表达融合蛋白Tumstatin_(183-230)-TRAIL,并观察其生物学功能。方法:利用重组PCR技术扩增Tumsta- tin_(183-230)-TRAIL(Tu-T)的融合编码序列.构建pMAL—Tu—T融合蛋白表达载体,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,得到MBP—Tu—T融合蛋白.用SDS-PAGE鉴定纯化的表达产物。通过体外内皮细胞增殖抑制实验、肿瘤细胞杀伤实验、体外管腔形成抑制试验及电镜检测细胞凋亡情况对其生物学双功能进行鉴定。结果:融合蛋白MBP—Tu—T在BL21中表达率约20%.可明显抑制内皮细胞增殖(IC_(50)12.5μg/ml),杀伤、诱导胰腺癌细胞凋亡并抑制体外管腔形成。结论:融合蛋白MBP-Tu-T具有双功能生物学活性,为进一步研究其靶向性杀伤肿瘤奠定了基础。
- 任娜王梁华高云孙铭娟焦豫良郭爱云焦炳华
- 关键词：融合蛋白生物学功能
- DR5来源的反义多肽FR-11的合成及其抑制TRAIL介导细胞凋亡的活性研究
- 2008年
- 目的：筛选出能影响配体TRAIL功能的死亡受体DR5来源的反义多肽。方法：依据蛋白质密码理论，编写可按参数要求进行氨基酸序列匹配比对的生物学软件，利用该软件对TRAIL（序列Ⅰ）和DR5（序列Ⅱ）进行比对。寻找两序列间的反义同源盒匹配序列。结合蛋白质和配体-受体复合物的结构信息，进一步理论筛选相互作用区域，合成可能与TRAIL作用的小分子活性肽。采用ELISA结合和竞争实验，分析所合成多肽与TRAIL的结合；在TRAIL诱导细胞凋亡实验中，分析与死亡受体竞争结合TRAIL的程度，观察多肽影响TRAIL介导细胞凋亡的生物活性。结果：经软件初筛选和理论分析，共合成10条多肽。通过ELISA结合实验筛选到一条多肽（命名为“FR-11”），能与TRAIL发生浓度依赖性的特异结合，并能抑制DR5与配体TRAIL的结合。该多肽与TRAIL97～103aa的匹配率大于50％，计算机模拟三维结构显示该序列位于DR5的胞外区，是与TRAIL结合的关键区域。细胞学实验表明：FR-11肽能够抑制TRAIL介导的SW1990细胞和L929细胞的凋亡，这种抑制作用呈FR-11浓度依赖性，而在TRAIL浓度较低时更为明显，提示能抑制TRAIL与死亡受体的结合。结论：根据蛋白质密码理论设计的软件能筛选出影响配体-受体相互作用的功能反义多肽；某些多肽能模拟受体与配体发生结合，具有抑制配体介导的生物活性。
- 高云王梁华孙铭娟任娜宗英焦炳华
- 关键词：DR5TRAIL细胞凋亡
- 新型聚酮合酶基因簇的分离与部分鉴定被引量：5
- 2008年
- 目的从海洋沉积物中分离新型聚酮合酶(PKS)基因簇,并解析其基因结构,为研究PKS的组合生物合成提供新组件。方法采集中国东海沉积物样本,并提取宏基因组DNA,以其为模板,通过简并PCR扩增新型PKS片段,用地高辛标记正确的扩增片段作为探针,然后从本研究中构建的海洋沉积物样本Fosmid宏基因组文库中筛选完整基因簇,测序、结构分析。结果(1)所分离得到的海洋沉积物宏基因组DNA可直接作为PCR模板,简并PCR扩增得到26个新型KS编码片段,并成功提交GenBank;(2)所得DNA构建成滴度约5×108cfu/ml的Fosmid文库,插入片段平均长度约为40kb;(3)将其中的一个KS片段(GenBank登录号DQ942531)用地高辛标记并筛选部分文库,得到4个克隆,测序得到7981bp的序列(GenBank登录号EF568935),结构分析发现含典型的I型PKS组件,如酮缩酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酰基载体蛋白(ACP)等。结论简并引物扩增、宏基因组文库筛选、测序、结构分析,在本研究中被证明是有效的分离新PKS基因簇的途径;通过系统进化树分析得出26条新KS片段属于Ⅰ型KS片断和杂合PKS/NRPS基因簇,主要来自放线菌门、δ变形菌门、蓝藻门和β变形菌门的微生物。
- 焦豫良王梁华董晓毅宗英高云任娜郭爱芸张兴群焦炳华
- 关键词：海洋沉积物聚酮合酶基因簇组合生物合成
- 新型酰基转移酶AT-EF080951的重组表达及底物结合分析
- 2008年
- 目的研究新型聚酮合酶(PKS)基因簇EF568935(GenBank登录号)中酰基转移酶(AT)EF080951(GenBank登录号)底物特异性,为PKS的功能研究及组合生物合成研究提供新组件。方法从酰基转移酶AT-EF080951结构域两端的连接肽区设计引物,通过PCR克隆其结构域基因at-EF080951;连接入原核表达载体pMAL-c2X,与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达;直链淀粉树脂柱亲和层析纯化MBP-AT-EF080951;融合蛋白用Xa因子切除MBP,得到AT-EF080951单体;以MBP、小牛血清白蛋白(BSA)为对照蛋白,用紫外分光光度法测定MBP-AT-EF080951与AT-EF080951对底物的结合能力,计算结合常数(Ka,μmol/L),分析其结合底物的特异性。结果(1)MBP-AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.0049±0.001;丙二酰辅酶A,0.0049±0.003;乙酰辅酶A,0.107±0.002;辅酶A,0.005±0.003。(2)AT-EF080951与底物的结合常数为:甲基丙二酰辅酶A,0.005±0.002;丙二酰辅酶A,0.0041±0.002;乙酰辅酶A,0.120±0.001;辅酶A,0.0042±0.003。结论MBP-AT-EF080951和AT-EF080951都特异性结合乙酰辅酶A,AT-EF080951可能是乙酰转移酶。
- 焦豫良王梁华董晓毅宗英高云任娜郭爱芸张兴群焦炳华
- 关键词：聚酮合酶酰基转移酶乙酰基转移酶组合生物合成
