李俊刚
- 作品数：53 被引量：134H指数：5
- 供职机构：第三军医大学西南医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划第三军医大学西南医院临床研究专项基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- 生物人工肝细胞材料研究进展被引量：4
- 2002年
- 肝细胞是生物人工肝(bioartificial liver, BAL)中的核心生物成分,其研究颇受国内外学者的重视。猪肝细胞具有类似人肝细胞的高代谢功能,在BAL中可作为人肝细胞的替代品。重组具有氨清除等功效的人肝细胞系在BAL中取得了较好成效,具有一定的应用前景。为了探索一种永生化的、无致瘤性的、有分化功能的人肝细胞系,作为BAL生物成分的理想细胞来源,国外学者研究设计了一种可回复性永生化程序,为解决细胞材料问题提供了新的思路和手段。肝非实质细胞及某些种类细胞,对维持肝细胞的三维结构的生存环境,改善肝细胞的代谢活性和存活起重要作用,与肝细胞混合培养后明显促进肝细胞的增生和分化,其在BAL系统中的潜在价值已逐渐引起注意。然而,肝细胞的增生、长期培养、功能维持及人源肝细胞的严重短缺等都是亟待解决的问题。
- 李俊刚陈耀凯
- 关键词：生物人工肝肝功能衰竭
- 逆向斑点杂交检测乙型肝炎病毒基因型及YMDD变异被引量：4
- 2006年
- 目的应用逆向斑点杂交技术检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型及YMDD变异。方法合成有生物素标记的引物,PCR扩增两种DNA片段,与尼龙膜上的探针同时杂交,BCIP/NBT显色。结果检测21例拉米夫啶治疗中的慢性乙型肝炎患者,11例HBV为基因型B,10例为基因型C;YMDD基序有47·6%(10/21)为YMDD,28·6%(6/21)为YVDD,23·8%(5/21)为YIDD。结论在同一张尼龙膜上检测HBV基因型及YMDD变异,经济实惠、准确快捷,且易于开展。
- 黄燕萍兰林李俊刚丁世涛范燚王宇明
- 关键词：基因型
- 肝细胞永生化逆转录病毒载体pLTSN的构建
- 2005年
- 目的构建含猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)的逆转录病毒永生化载体pLTSN,为肝细胞永生化奠定基础。方法以质粒pUC19-SV40T为模板,高保真PCR扩增SV40T,双粘端连接法将其克隆到pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间,通过菌落PCR和酶切法筛选、鉴定阳性克隆并经测序验证。结果用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中9个为阳性,阳性克隆经质粒DNA测序分析确证。结论成功构建了逆转录病毒永生化载体pLTSN。
- 李俊刚陈耀凯王宇明
- 关键词：SV40聚合酶链反应菌落
- 55例不明原因肝炎患者血清和肝组织HBV的检测
- 蒋黎丁世涛李俊刚章蓉
- 小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究被引量：4
- 2006年
- 目的将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的C57/BL6小鼠脾脏,检测HPCs在小鼠脾脏内分化和移植细胞的功能及其在脾脏组织中的整合情况,探讨肝细胞合适的替换治疗细胞来源。方法体外培养ESC并制备拟胚体(EBs),体外诱导EBs 18 d后得到HPCs,然后用Hochest 3342荧光标记HPCs并制备成6.0×107/m l细胞悬液。移植受体小鼠用2乙-酰氨基芴(2-AAF)处理,移植前受体鼠经过7 Gy60Coγ全身辐照和50%肝脏切除,造成小鼠体内对肝细胞的极大需求;然后将0.1 m l含6.0×106HPCs细胞悬液经尾静脉注射移植入脾脏,细胞移植4周后,检测移植细胞在小鼠脾脏整合分化情况。结果体外培养ESC并制备出EBs,EBs经体外诱导为HPCs,并将HPCs移植到小鼠脾脏,4周后观察到移植细胞能够嵌合到受体脾脏组织,在脾脏组织中未形成畸胎瘤,并且移植细胞能表达肝细胞较特异标志物白蛋白、CK19和糖原PAS染色呈阳性反应。结论本实验建立一种将体外ESC诱导的HPCs移植并整合到脾脏的细胞移植技术,为研究肝细胞分化的分子机制和肝病的细胞替换治疗提供基础。
- 江海洪王宇明刘国栋陈耀凯李俊刚赵文利
- 关键词：胚胎干细胞肝前体细胞细胞移植2-乙酰氨基芴
- 可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox的构建与表达
- 目的以hTERT作为永生化基因、嘌呤霉素乙酰转移酶基因puro作为筛选基因、加强型绿色荧光蛋白EGFP作为报道基因、loxP作为重组位点构建可回复性永生化逆转录病毒载体,为建立可回复性永生化细胞株奠定基础。方法用Nhe ...
- 李俊刚陈耀凯王宇明
- 关键词：永生化基因
- SV40T外显子的拼接及逆转录病毒载体pLLTSN的构建被引量：3
- 2004年
- 目的:为构建肝细胞永生化载体,对猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)外显子进行拼接并以其为外源片段构建逆转录病毒永生化载体pLLTSN. 方法:以质粒pUC19-SV40T为模板,高保真PCR扩增SV40T的2个外显子,重叠延伸拼接法将两个外显子拼接到一起,然后用双粘端连接法将其克隆到空载体pLXSN 的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间,通过菌落PCR和酶切法筛选,鉴定阳性克隆并经DNA测序验证. 结果:拼接成2.1 kb的SV40T,用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中4个为阳性,均含有2.1 kb SV40T插入片段.经质粒DNA测序分析的阳性克隆,确证无内含子. 结论:获得重组的2.1 kb无内含子的SV40T,成功构建了逆转录病毒载体pLLTSN.
- 李俊刚陈耀凯王宇明
- 关键词：逆转录病毒肝细胞抗原
- 可回复性肝细胞永生化载体pCTGTKlox的构建、鉴定、转染与表达
- 目的构建包括雌激素受体与重组酶的融合基因Cre-ER、永生化基因SV40T、加强型绿色荧光蛋白与胸苷激酶的融合基因EGFP-TK以及重组位点loxP序列的可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础。方法...
- 陈耀凯李俊刚王宇明
- 关键词：逆转录病毒肝细胞永生化
- 构象敏感凝胶电泳用于检测乙型肝炎病毒P区核苷类似物耐药准种的初步研究被引量：2
- 2007年
- 目的建立经济、实用、准确的乙型肝炎病毒准种分析方法。方法采用"PCR-克隆-测序"的方法,对2例血清样本的各60个克隆测序,χ2检验分析所研究克隆毒株的数量对准种组成反映准确性的影响;用建立的构象敏感凝胶电泳(CSGE)法区分克隆目的片段,比对CSGE结果与测序结果的一致性。结果对于优势准种比例的反映检测15个克隆以上(χ2=2.700,P=0.100>0.05)、对劣势株的检出检测30个以上则与检测60个克隆无统计学差异(χ2=2.411,P>0.05);比较8个样本共270个克隆的CSGE及测序结果,两者表现出良好的对应性(准确率达98.9%)。结论用"PCR-克隆-CSGE-测序"的方法视不同需求检测15或30个克隆可准确反映1份血清样本中HBV准种的组成和分布。
- 刘霖汤影子王宇明王小红周吉军李俊刚
- 关键词：肝炎病毒乙型准种构象敏感凝胶电泳
- 可回复性肝细胞永生化载体pCTGTKlox的构建、鉴定、转染与表达被引量：4
- 2006年
- 目的构建可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础。方法扩增加强型绿色荧光蛋白(EGFP)及胸腺激酶(TK)并采用重叠延伸拼接法(SOE)连接EGFP和TK,将EGFP-TK融合基因亚克隆至pBABE-puro-lox,构建成新载体pBGTKlox,再将永生化基因SV40T连接至pBGTKlox,构成新载体pBTGTKlox,最后将雌激素受体与重组酶融合基因(Cre-ER)连接至pBTGTKlox,构成新载体pCTGTKlox。将pCTGTKlox和pPDF15质粒共转染包装细胞PT67,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。免疫组化染色检测SV40T基因的表达。结果成功构建包含EGFP-TK、SV40T、Cre-ER及重组序列loxP的新载体pCTGTKlox,经酶切鉴定证实为重组阳性体,经测序验证无核苷酸突变。pCTGTKlox转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光。免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色。结论成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pCTGTKlox,为细胞的可回复性永生化提供了一种良好的新型载体。
- 陈耀凯李俊刚王宇明
- 关键词：逆转录病毒永生化肝细胞
