赖兴强
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 供职机构：中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 基于episomal CRISPR/Cas9载体的基因敲入方法
- 2018年
- 【目的】研究一种在哺乳动物细胞中高效的基因敲入方法,比较带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体的基因敲入效率是否有差别。【方法】首先利用慢病毒载体构建稳定表达红色荧光蛋白DsRedE2的人胚肾细胞系(293FT)与人诱导多能干细胞系(hiPS);利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计和合成靶向DsRedE2的向导RNA(sgRNA),分别克隆至带有oriP-EBNA1的episomal CRISPR/Cas9敲除载体与普通CRISPR/Cas9敲除载体中,测序筛选插入正确片段的克隆;然后设计靶向DsRedE2的同源臂,把同源臂连接在绿色荧光蛋白(GFP)的两端,构建GFP敲入片段的载体。把两种敲除载体分别导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间点通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲除效率,同时利用PCR检测靶基因的敲除情况;在筛选获得有效的sgRNA片段后,把两种敲除载体和同源臂同时导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲入效率,同时利用PCR检测DsRedE2序列中GFP的敲入情况。【结果】成功构建表达DsRedE2的293FT与hiPS细胞系;获得靶向DsRedE2的episomal CRISPR/Cas9敲除载体、普通CRISPR/Cas9敲除载体及带有GFP的同源臂载体;荧光显微镜观察与流式细胞分析结果显示,转染两种CRISPR/Cas9质粒均可以使DsRedE2阳性细胞明显减少,而且episomal CRISPR/Cas9质粒组的DsRedE2阳性细胞数量显著低于转染普通CRISPR/Cas9质粒组。同时,敲入实验证实episomal CRISPR/Cas9组的GFP阳性细胞数量比普通CRISPR/Cas9组更多;TA克隆测序证实打靶位点有敲除与敲入片段。【结论】episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体在细胞上都能实现基因的敲除与敲入;带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体敲除和敲入的效率均比普通CRISPR/Cas9载体高。以上结果为利用episomal CRISPR/Cas9载体进�
- 邹征伟赖兴强李伟强
- 人诱导多能干细胞向外周神经元分化的实验研究被引量：1
- 2014年
- 【目的】探讨人诱导多能干细胞(hiPS细胞)在体外向外周神经元分化的能力。【方法】人诱导多能干细胞在无饲养层培养条件下维持培养,然后在神经培养基中悬浮培养分化为神经球,通过把神经球贴壁在多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的培养板上,利用流式分选细胞方法获得神经嵴干细胞(NCSC),通过把神经嵴干细胞在外周神经诱导培养基中诱导分化,获得外周神经元,利用免疫荧光染色的方法检测神经嵴干细胞和外周神经元的标记物。【结果】贴壁的神经球出现特征性的神经花环(Neural rosettes)结构,神经嵴干细胞从神经花环发生迁移;神经嵴干细胞向外周神经元诱导后出现神经丝结构,并表达外周神经元特异性标记物。【结论】人诱导多能干细胞在体外能高效向外周神经元分化。
- 林婉颐黄利华周立文石翾赖兴强李伟强
- 不同光谱的发光二极管阵列光源照射对体外游离胆红素光化学降解效应的影响被引量：4
- 2011年
- 目的:探讨三种不同光谱范围的发光二极管(LED)阵列光源对体外游离胆红素降解效应的影响。方法:将500μL浓度为205.2μmol/L的胆红素标准液封入5mL的耐热玻璃管制成一个样本管。将所有共54个样本管分为三组,分别经相同光照强度的蓝光、蓝绿混合光和绿光LED阵列照射0h、0.5h、1h、2h、4h和8h,然后通过咖啡因法检测胆红素溶液的吸光度值。结果:与空白对照组比较,蓝光、蓝绿混合光和绿光LED光照均对胆红素有明显的降解作用(P<0.05);其中又以蓝光LED的光化学降解效应最强。结论:光谱是影响新生儿黄疸LED光疗疗效的重要参数,并且蓝光(465±20)nm为LED光疗较适宜光谱范围。
- 胡江李晓原赖兴强刘建中吴俊超唐琳
- 关键词：新生儿黄疸光谱游离胆红素
