黄宏亮
- 作品数：6 被引量：22H指数：4
- 供职机构：江苏大学基础医学与医学技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省自然科学基金浙江省教育厅科研计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- ANX A2在抗磷脂抗体诱导THP-1细胞组织因子表达中的作用被引量：2
- 2009年
- 目的:构建针对人膜联蛋白A2(ANXA2)的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,转染THP-1细胞,探讨ANXA2在抗磷脂抗体(APL)诱导单核细胞组织因子(TF)表达中的作用。方法:设计4条ANXA2特异性RNAi的寡核苷酸序列,与慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,PCR及测序鉴定正确后,Western蛋白印迹法筛选出有效干扰序列。包装293T细胞获得重组慢病毒LV-RNAi-ANXA2,感染单核细胞株THP-1,观察细胞ANXA2 mRNA和蛋白表达下降程度。再用APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,观察TFmRNA表达及TF活性变化。结果:成功构建RNAi慢病毒载体并筛选出有效干扰片段;包装293T细胞后病毒滴度为3×1012TU/L;感染THP-1后细胞ANXA2 mRNA和蛋白均被沉默。APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,其TF表达下降至基础水平。结论:构建的慢病毒表达载体能显著抑制THP-1细胞ANXA2的表达,进而影响APL诱导的TF表达,证明ANXA2在APL诱导的单核细胞表达TF过程中具有重要作用。
- 李娜周红俞颖王婷黄宏亮石文霞王海波
- 关键词：膜联蛋白A2抗磷脂抗体
- β_2糖蛋白I纯化及其稳定性分析被引量：4
- 2008年
- 目的:从正常人混合血浆中纯化获得β2糖蛋白Ⅰ(β2GPI),并对提纯蛋白的纯度及稳定性进行分析。方法:采用HClO4沉淀、Heparin Sepharose CL-6B亲和层析柱等纯化β2GPI;利用SDS-PAGE、蛋白质印迹分析提纯蛋白的纯度;观察不同温度、NaCl浓度及防腐剂等条件下的β2GPI稳定性。结果:本法获得了高纯度目的蛋白β2GPI(>95%)。β2GPI在浓度低于0.8 mol/L的NaCl溶液中,置室温及4℃保存易降解变性,但在1.6 mol/L NaCl溶液中于室温及4℃保存60天均未见蛋白明显降解。结论:利用本法能够得到高纯度的β2GPI,在使用和保存β2GPI时要考虑到其降解的可能性,注意保存条件,必要时冻干保存。
- 黄宏亮周红王婷石文霞李娜王海波
- 关键词：Β2糖蛋白I蛋白纯化
- 兔抗人β_2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备与鉴定被引量：9
- 2009年
- 目的制备兔抗人β2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及功能活性。方法以纯化的人血浆β2糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)免疫新西兰大白兔,获得抗血清;利用Protein A及β2-GPI亲和层析柱纯化血清中总IgG和抗β2-GPI多克隆抗体;用免疫双向扩散试验(IDD)、ELISA和western-blot等方法鉴定抗体。结果IDD及ELISA鉴定抗体效价分别达到16和1×105;western-blot显示纯化的总IgG和抗β2-GPI抗体与β2-GPI蛋白均有特异反应条带;且抗体与β2-GPI复合物能够刺激单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)活性。结论成功获得并纯化兔抗人β2-GPI多克隆抗体,为进一步研究β2-GPI/抗β2-GPI复合物在抗磷脂抗体综合征血栓形成机制中的作用建立了基础。
- 黄宏亮周红俞颖李娜石文霞王婷王海波
- 关键词：多克隆抗体抗磷脂抗体综合征
- 凝血因子Ⅶa促进SW620细胞增殖与迁移的机制探讨被引量：7
- 2009年
- 目的体外探讨凝血因子Ⅶa促进结肠癌细胞株SW620增殖与迁移的作用机制。方法采用蛋白酶激活受体2激动剂（PAR2-AP）、凝血因子Ⅶa等处理SW620细胞，以实时定量PCR检测SW620细胞中自细胞介素8（IL-8）、组织因子（TF）及半胱氨酸蛋白酶7（caspase-7）mRNA的表达水平；以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清IL-8蛋白的含量；以Xa生成法检测细胞TF活性；以Western blot法检测细胞磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（P—p38MAPK）水平。结果PAR2-AP、凝血因子Ⅶa能够增加SW620细胞中IL-8基因和蛋白的表达，上调TFmRNA水平及活性，下调caspase-7基因表达和P-p38MAPK水平，单克隆抗TF及抗PAR2抗体均可抑制凝血因子Ⅶa的作用。结论凝血因子Ⅶa与细胞表面TF形成复合物，通过活化PAR2，上调结肠癌细胞株SW620中IL-8、TF的表达，下调细胞caspase-7表达，从而促进细胞增殖与迁移能力，p38MAPK在此过程中起负性调节作用。
- 石文霞周红李娜黄宏亮周保成
- 关键词：结肠肿瘤细胞增殖
- FⅦa依赖TF及FⅩ活化PAR2上调SW 620细胞IL-8表达被引量：4
- 2009年
- 目的探讨凝血FⅦa、Ⅹ、Ⅱa在蛋白酶激活受体2(PAR2)活化及诱导SW620细胞IL-8表达中的作用。方法用PAR2激动剂(PAR2-AP)、FⅦa、Ⅹ、Ⅱa等不同刺激物处理SW620细胞,以ELISA法检测细胞上清IL-8水平,以实时定量PCR检测细胞IL-8mRNA表达。结果血浆浓度的Ⅶa需在FⅩ存在下才能促进细胞IL-8表达;单克隆抗TF及抗PAR2抗体均可抑制FⅦa的作用;FⅡa轻微下调细胞IL-8表达,Hirudin、抗PAR1及抗PAR2抗体均可阻断此作用。结论TF-FⅦa及TF-FⅦa-FⅩa复合物,而非FⅡa,活化PAR2上调SW620细胞IL-8表达,从而促进细胞增殖及迁移。
- 石文霞周红李娜黄宏亮周保成
- 真核表达质粒pIRES_2-eGFP-Annexin A2的构建及其在293T细胞中的表达被引量：1
- 2009年
- 目的:构建含有人Annexin A2基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP-Annexin A2,并在真核细胞293T中表达。方法:将质粒pCMV5-Annexin A2上Annexin A2基因酶切后与真核表达质粒pIRES2-eGFP连接,酶切鉴定及测序正确后,脂质体介导法转染293T细胞,荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达。结果:构建的质粒pIRES2-eGFP-Annexin A2转染293T细胞后,目的基因mRNA和蛋白表达均明显增高。结论:成功构建pIRES2-eGFP-Annexin A2质粒并表达蛋白,为研究Annexin A2的生物学功能奠定了基础。
- 李娜周红俞颖王婷黄宏亮石文霞王海波
- 关键词：ANNEXIN真核表达抗磷脂综合征
