张成
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 改造细胞质膜促进途径酶组装及N-乙酰氨基葡萄糖合成
- 2021年
- 功能膜微域(FMMs)可以作为内源性空间支架进行途径酶组装,适度地提高FMMs在质膜中的占比能够明显提高产物合成量,然而对FMMs进行改造后,细胞生长和产物的合成均受到抑制。在课题组前期研究的基础上,对细胞质膜进行理性改造以缓解FMMs过度改造对细胞造成的影响。首先通过过表达PlsX,PlsY和PlsC改造细胞质膜,之后,以枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为例,发现质膜改造的菌株中GlcNAc产量达到(5.18±0.16)g/L,与对照菌株相比产量提升了41.9%,同时,细胞质膜改造也明显降低FMMs过度修饰对菌株生长产生的不利影响。
- 张成张成金柯李江华堵国成李江华
- 关键词：细胞质膜N-乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌
- 产1,3-丙二醇新型基因工程菌的构建被引量：6
- 2009年
- 以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中,往往由于还原力NADH的不足,限制了1,3-丙二醇的合成,引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积,进而抑制甘油脱水酶的活性,阻碍菌体的生长,严重影响1,3-丙二醇的合成途径.为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾,本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因,构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT,成功共转入E.coliJM109,得到可利用两种辅酶(NADH、NADPH)将甘油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,发酵结果表明,1,3-丙二醇产量提高了28.6%.
- 方慧英张成诸葛斌诸葛健
- 关键词：3-丙二醇3-羟基丙醛重组大肠杆菌共表达甘油
- 大肠杆菌aroG基因的定点突变及与trpBA基因的串联表达被引量：4
- 2013年
- 为了提高大肠杆菌生产色氨酸的产量,以大肠杆菌中aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS)与trpBA基因编码的色氨酸合成酶(TSase)两个关键酶为研究对象,利用SOE-PCR方法对aroG基因进行632位碱基定点突变,获得抗反馈抑制的定点突变aroGf br基因,并与扩增获得trpBA基因串联于pEtac表达载体上共表达,获得重组菌Escherichia coli JM109/pEtac-aroGfbr-tac-trpBA,同时构建对照菌株E.coli JM109/pEtac-aroG-tac-trpBA.两种串联表达质粒重组菌的DAHPS酶活性,分别比含空载体出发菌株相应酶的活性提高4.3倍和3.8倍,突变DAHPS酶活提高1.13倍.摇瓶发酵表明,所构建的两菌株与出发菌株色氨酸产量相比较,分别提高8.23倍和11.47倍,带突变aroGf br基因的菌株比对照菌株色氨酸产量提高1.4倍,色氨酸产量明显提高,说明突变菌株能有效解除苯丙氨酸的反馈抑制作用.
- 郝大利诸葛斌方慧英张成宗红诸葛健
- 关键词：色氨酸大肠杆菌基因定点突变
- 促进氰钴胺素转化为腺苷钴胺素的基因表达与鉴定被引量：1
- 2012年
- 辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12.
- 翟伟锋方慧英诸葛斌张成薛颖敏诸葛健
- 关键词：甘油钴胺素辅酶B12重组菌
- 高渗工业菌株Candida glycerinogenes整合型表达载体的构建及验证被引量：2
- 2015年
- 构建应用于工业用产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CGMCC NO.6830的整合型表达载体,建立一种可利用底物形成的渗透压调控表达外源基因的体系。以p UC19质粒为基本骨架,C.glycerinogenes CGMCC NO.6830的18S r DNA为整合位点,运用其3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PCggpd启动外源基因表达,腐草霉素抗性基因ble作为重组酵母转化子筛选标记,获得应用于产甘油假丝酵母的稳定的表达型整合载体;以绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因考察该表达质粒的性能,实现了外源基因gfp的渗透压调控表达。
- 徐丹陆信曜诸葛斌张成宗红
- 关键词：产甘油假丝酵母绿色荧光蛋白
- 新型渗透压调控的工业酵母启动子被引量：5
- 2015年
- 【目的】筛选工业酵母Candida glycerinogenes渗透压调控性能优越的启动子,为工业酵母改造及转基因研究提供新途径。【方法】PCR扩增C.glycerinogenes新型系列启动子PCg PGI、PCg TPI、PCg ZWF、PCg STL1、PCg STL2、PCg STL3,利用生物信息学技术解析启动子序列中渗透压胁迫应答元件,构建包含gfp荧光蛋白报告基因和PCg PGI、PCg TPI、PCg ZWF、PCg STL1、PCg STL2、PCg STL3启动子的5.8S r DNA整合表达载体,通过荧光强度及mRNA转录的qRT-PCR测定结果检验各启动子活性强度及其受渗透压调控情况。【结果】启动子PCg STL3包含多个STRE渗透压胁迫应答元件,在工业酵母中受渗透压调控更敏感,启动强烈,转录水平高,gfp表达量大。【结论】PCg STL3是受渗透压调控能够实现外源基因可控表达的优良工业酵母启动子。
- 朱佳莉诸葛斌方慧英宗红陆信曜张成张炜极
- 关键词：产甘油假丝酵母绿色荧光蛋白
- 产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pEtac-dha B-tac-yqh D)的构建
- 2009年
- 在生物柴油的生产过程中,最高可得到约10%的副产物甘油,副产物甘油的去向将成为生物柴油大规模产业化发展所面临的严峻问题。以生物柴油副产物甘油为原料耦合生产1,3-丙二醇,不仅解决了生物柴油副产物甘油的出路问题,同时降低了1,3-丙二醇的生产成本。本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因 yqhD,利用表达载体pEtac串联构建了重组质粒pEtac-dhaB-tac-yqhD,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pEtac-dhaB-tac-yqhD),降低了代谢中间产物3-羟基丙醛的积累,提高了1,3-丙二醇的产量。
- 张成诸葛斌方慧英诸葛健
- 关键词：生物柴油甘油重组大肠杆菌1,3-丙二醇
- 利用甘油脱水酶基因构建产3-羟基丙醛工程菌及其表达比较
- 2013年
- 3-羟基丙醛(3-HPA)是一种重要的化工产品,可由甘油经甘油脱水酶作用后生成.为获得产3-HPA基因工程菌,在已构建含甘油脱水酶基因及其激活因子大亚基质粒pEtac-dhaB-gdrA的基础上,构建了包含小亚基gdrB激活因子的重组质粒pEtac-dhaB-gdrA-gdrB.利用大肠杆菌通用tac启动子将该质粒在不同Escherichia coli BL21、DH5a及JM109中进行表达.阳性转化子经IPTG诱导后,提取总RNA,以cDNA为模板进行RT-PCR发现,目标基因在不同宿主都能较好转录.SDS-PAGE、酶活测定和3-HPA浓度测定结果表明,目标蛋白表达存在差异;酶活分别为4.7(±0.44)、3.5(±0.95)、8.1(±0.66)U/mg;发酵液中3-HPA的含量分别为0.012(±0.0044)、0.014(±0.003)、0.375(±0.018)g L-1,重组E.coli JM109/pEtac-dhaB-gdrA-gdrB具有较好的甘油脱水酶基因表达和产3-HPA性能.该基因工程菌与克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)相比,发酵副产物明显较少,有利于后期提取,为生产3-HPA提供了一条新思路.
- 杜好勉诸葛斌方慧英张成宗红诸葛健
- 关键词：甘油脱水酶3-羟基丙醛大肠杆菌发酵
- 克雷伯氏菌产1,3-丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析被引量：2
- 2013年
- 通过对野生克雷伯氏菌(Klebsiella)进行紫外诱变,获得一株耐高浓度甘油及高浓度1,3-丙二醇的突变菌株A-39-3,该突变株产1,3-丙二醇的量较野生菌株提高了58%,副产物2,3-丁二醇和乙醇的量分别降低了27%和19%.为探讨突变株高产1,3-丙二醇的原因,通过对突变菌株发酵过程中关键酶的酶活跟踪分析,发现1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力与野生菌株相差不大,甘油脱氢酶(GDH)的酶活力略有下降,而突变菌株的甘油脱水酶(GDHt)的酶活力明显高于野生菌株.并采用半定量RT-PCR方法,从转录水平上比较甘油脱水酶基因的差异,结果发现突变菌株A-39-3甘油脱水酶基因的相对mRNA转录水平是野生菌株K的2.58倍,分析说明该突变株1,3-丙二醇产量的提高与关键酶基因dhaB的mRNA转录水平关系密切.
- 聂玲燕方慧英诸葛斌宗红张成诸葛健
- 关键词：克雷伯氏菌1,3-丙二醇甘油脱水酶半定量RT-PCR
