王莉莉
- 作品数：17 被引量：99H指数：5
- 供职机构：中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划北京市自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生自然科学总论更多>>
- 利用体细胞核移植技术生产转基因牛被引量：32
- 2003年
- 通过电穿孔的方法,将含有新霉素抗性(Neor)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞,获得了转基因细胞株.以转基因细胞为核供体,进行了牛的体细胞核移植.重构胚胎424枚,其中208枚体外发育至囊胚,囊胚发育率为49.1％.选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内,共有5头受体牛妊娠,妊娠率为29.4％.经过正常的体内发育,有3头转基因克隆牛出生,产犊率为17.6％.PCR和Southern检测结果表明,3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因.并且,绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达.上述结果显示,通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛;所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎,应用于转基因克隆动物的生产,确保所培育的克隆动物均为转基因动物.
- 龚国春戴蕴平樊宝良朱化彬王莉莉王海平汤波刘颖李荣万荣黄银花李宁
- 关键词：体细胞核移植转基因绿色荧光蛋白
- 第一次减数分裂期小鼠卵母细胞的化学去核被引量：6
- 2004年
- 通过免疫荧光染色法确定了小鼠第一次减数分裂的进程 ,在此基础上分别用脱羧秋水仙碱和放线菌酮处理成熟培养的小鼠卵母细胞 ,抑制其纺锤体极间微管的延长和降低成熟促进因子的浓度 ,使其核物质随极体全部排出 .结果表明 :(1)卵母细胞从有腔卵泡中分离时处于生发泡期 ,可见核仁 ;成熟 2h内则全部发生生发泡破裂 ;培养 5h ,90 %到达第一次减数分裂的前中期 ;培养 8h ,则 33.3%处于中期 ;71.4 %的细胞在成熟 12h后发育为后期 ;第二次减数分裂的中期则于成熟培养 15h发生 .(2 )于成熟的不同时间取卵母细胞 卵丘细胞复合体进行去核处理后发现 ,体外成熟培养 5h(即卵母细胞处于第一次减数分裂前中期时进行处理 ) ,其去核率最高 ,达85 .6 % ;成熟 5h之前各组随成熟培养时间的延长而去核率升高 ,之后各组则降低 .(3)比较卵母细胞 卵丘细胞复合体与自然裸卵去核率 ,后者效率为 5 6 % ,显著低于前者 (p <0 .0 5 ) ,因此该方法在卵母细胞 卵丘细胞复合体的完全去核率与传统的物理去核方法相当 .
- 杜卫华李世杰李彦欣戴蕴平王莉莉王美丽郑敏李宁
- 关键词：卵丘细胞放线菌酮减数分裂有腔卵泡
- 转基因和再克隆对克隆胚胎细胞凋亡的影响被引量：3
- 2009年
- 细胞凋亡在着床前胚胎发育过程中发挥着重要作用,胚胎凋亡检测能为获得高质量的体细胞克隆胚胎提供有益信息,进而有助于提高克隆效率.用原位末端标记法对牛的转基因克隆和转基因再克隆囊胚进行了细胞凋亡检测,再克隆囊胚是利用转基因克隆牛的体细胞作为供体细胞进行体细胞核移植后获得的第二代克隆胚胎.结果表明转基因克隆胚胎的囊胚发育率显著低于非转基因克隆胚胎的囊胚发育率,而转基因克隆囊胚的细胞凋亡指数显著高于非转基因克隆胚胎的细胞凋亡指数.此外,转基因再克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数与非转基因克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数相比差异性不显著.结果表明早期的转基因克隆胚胎发育能力的减弱可能是由于供体细胞的基因转染和药物筛选过程导致的,而再克隆对其早期胚胎的发育能力没有负面影响.
- 孙国杰李荣戴蕴平王海平王莉莉刘颖丁方荣卫恒习李宁
- 关键词：凋亡
- 应用奶牛乳腺生物反应器高效生产重组人乳铁蛋白和人乳清白蛋白
- 李宁戴蕴平汤波龚国春张磊连正兴王莉莉王海萍刘颖郑敏樊宝良赵志辉
- 动物乳腺生物反应器是一种利用体细胞克隆与转基因方法在动物乳腺中高效生产重组蛋白的技术，具有效率高，成本低，安全环保以及重组蛋白具有天然活性等优点，已成为生物制药的最新发展阶段，其商业前景十分巨大。据美国商业评估公司预测到...
- 关键词：
- 关键词：动物乳腺生物反应器生物制药体细胞克隆技术转基因动物技术
- 人α-乳清白蛋白转基因奶牛的生产和应用
- 李宁戴蕴平汤波张磊王建武王莉莉王海萍郑敏李荣龚国春丁方荣赵建敏连正兴李秋艳李京
- 2005年转基因鱼在美国上市和2006年世界第一例转基因动物生产的重组蛋白药物在欧洲获准销售，展现出转基因动物技术在培育动物新品种和生产重组蛋白上的巨大应用前景，据美国商业评估公司预测到2015年全球转基因动物产品每年销...
- 关键词：
- 关键词：人工授精
- 体细胞克隆猪和转基因体细胞克隆猪技术平台的建立与应用
- 李宁李秋艳卫恒习戴蕴平张运海潘登科张磊汤波娄彦坤李燕马育芳李俊郭英王莉莉张坤赵蕊
- 体细胞克隆猪技术属于现代生物学高新技术领域，它是通过特定的技术手段，将猪的体细胞核导入到去核的成熟卵母细胞中形成克隆胚胎，然后在特定阶段把克隆胚胎移植到代孕母体的子宫内完成发育，得到与供体细胞在遗传上完全一致的后代。体细...
- 关键词：
- 关键词：克隆猪体细胞克隆转基因
- 以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎被引量：35
- 2003年
- 利用所构建的含新霉素抗性(Neo^r)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双标记选择载体,通过电穿孔的方法,分别转染了牛胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、胎儿卵巢上皮细胞、颗粒细胞,经过800μg/mL的 G418筛选14 d后,均获得了阳性细胞株.分别以未转基因牛颗粒细胞和4种细胞系的转基因细胞为核供体,进行了牛的体细胞核移植.结果表明:(i)转基因与未转基因牛颗粒细胞的重组胚的囊胚发育率(44.6％vs 42.8％)、移植妊娠率(19％ vs 25％)差异不显著(P>0.05);(ii)比较4种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿输卵管上皮细胞(49.1％)和颗粒细胞(44.6％)最高,牛胎儿成纤维细胞(37.2％)次之,胎儿卵巢上皮细胞的重组胚囊胚发育率(22.5％)最低,三者之间差异显著(P<0.05).以上结果显示,供体细胞的转基因与否对牛克隆胚胎的体外和体内早期发育影响不明显;通过体细胞核移植技术,牛胎儿输卵管上皮细胞和颗粒细胞可以有效地生产牛转基因囊胚,并且绿色荧光蛋白作为一种无毒性作用的筛选标记,可用于转基因胚胎的筛选.
- 龚国春戴蕴平樊宝良朱化彬王海平王莉莉方昌阁万荣刘颖李荣李宁
- 关键词：转基因细胞核供体核移植绿色荧光蛋白囊胚克隆胚胎
- 低氧对牛体细胞体外增殖的影响被引量：1
- 2012年
- 本研究通过比较常氧(20%)和低氧(5%)环境下培养牛体细胞的生长效果,进而探讨低氧对牛体细胞体外增殖的影响。选用牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞)分别在常氧和低氧2种培养环境下进行连续传代培养和细胞克隆培养,并对其倍增水平和细胞克隆形成效率作比较分析。结果显示,5%的低氧环境对这3种细胞的体外增殖均有促进效果,而且各细胞的增殖水平(50.61±2.47、16.35±0.43、43.38±0.84)均显著高于常氧组(27.42±0.23、12.14±0.83、32.76±1.53,P<0.01)。以500个·皿-1(直径100mm)的细胞浓度接种培养的情况下,低氧培养的胎儿输卵管上皮细胞的克隆形成效率((53.05±4.62)%)显著高于常氧组((36.68±5.68)%)(P<0.01),而低氧组胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞获得的细胞克隆数只是略多于常氧组,差异并不显著(P>0.05)。当以1个.孔-1的细胞浓度接种于96孔板培养时,低氧组各类细胞的单细胞克隆形成效率((21.60±2.37)%、(22.29±5.42)%、(27.92±3.69)%)显著高于常氧组((12.01±1.42)%、(7.92±2.86)%、(10.49±3.07)%)(P<0.01或P<0.05)。将体外培养条件的常氧含量(20%)调减至更接近体内生理状况的低氧含量(5%)可以延长牛体细胞增殖寿命和提高单细胞克隆形成效率,对细胞生长有很好的促进作用。
- 李松丁方荣王海萍王莉莉李京郑敏王美利王超戴蕴平朱士恩
- 关键词：低氧牛体细胞体外增殖
- 无血清培养基IVD101和G1/G2在牛体细胞核移植中的应用研究被引量：3
- 2008年
- 通过考察牛体细胞核移植重构胚在无血清培养基(IVD101、G1/G2)条件下培养的囊胚发育率及其质量,从而评估无血清培养基支持牛体细胞核移植重构胚体外发育的能力。采用IVD101和G1/G2对牛体细胞核移植胚胎进行体外培养,并以CR1aa+5%FBS作为对照组。无血清培养基IVD101和G1/G2的囊胚发育率与对照组无显著性差异(41.2%±9.1%、42.2%±10.8%,48.0%±9.2%,P>0.05)。通过囊胚差异染色和冷冻/解冻胚胎存活率分析胚胎质量,发现无血清培养基ICM/Total略低于对照组(31.8%±10.5%、29.5%±11.9%vs.33.0%±14.8%),但无显著性差异(P>0.05);3个组别的囊胚经程序化冷冻/解冻后无血清培养基的存活率(IVD101、G1/G2)略高于对照组,但差异不显著(84.8%、80.4%vs.77.3%,P>0.05)。结果证明无血清培养基(IVD101、G1/G2)可以支持体细胞核移植重构胚的体外发育,且其对程序化冷冻的耐受性与添加血清组(CR1aa+5%FBS)相似。
- 李荣刘颖赵兴波王莉莉王海萍丁方荣李京李松高凤磊戴蕴平
- 关键词：无血清培养基体细胞核移植胚胎冷冻
- 人α-乳清蛋白基因的克隆及其在转基因小鼠中高效表达被引量：7
- 2004年
- 从粘粒文库中筛选出人α 乳清蛋白基因 ,构建 9 5kb的转基因表达载体 .利用显微注射的方法获得 6 8只F0 代小鼠 ,经PCR检测和DNA印迹分析证实有 8只小鼠 (4 ♂ ,4♀ )为整合人α 乳清蛋白基因的转基因阳性小鼠 ,整合率为 11 7% ,整合拷贝数在 1至 8之间 .利用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和蛋白质印迹分析 ,4只雌性F0 代转基因阳性小鼠全部表达了人α 乳清蛋白 .放射免疫测定法测定 ,含量分别为 0 6 2g/L、 0 4 8g/L、0 5 6 g/L、 3 2 1g/L ;同时测定F0 代 5 0号转基因公鼠的后代阳性母鼠 (5 0 2号 )乳样中人α 乳清蛋白含量也达到 1 0 3g/L ,证明由原代转基因公鼠遗传给后代的人α 乳清蛋白基因亦获得了稳定的表达 .所构建的人α 乳清蛋白转基因载体具有结构较小 ,表达量高 ,可以稳定遗传等优点 .为利用人α 乳清蛋白基因改善牛乳成分和品质奠定了基础 .
- 于舒洋曹更生樊宝良李宁段颖莉戴蕴平王莉莉
- 关键词：基因克隆转基因小鼠乳汁
