肖慧
- 作品数：29 被引量：79H指数：5
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- 利用生物素-链亲和素系统筛选呼吸机所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白
- 2009年
- 目的:筛选呼吸机所致肺损伤(VILI)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离HMGB1启动子-蛋白反应复合物,分别用0.25mol/L和1mol/LNaCl洗脱探针上结合的蛋白,SDS-PAGE电泳分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较VILI组与正常对照组的差异条带.结果:两组细胞核蛋白中共观察到24条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,机械通气后有6个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有2个蛋白的结合力减弱;在高亲和力作用水平,有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱.结论:筛选到一些VILI特异性HMGB1启动子结合蛋白,对于研究HMGB1的转录调控机制具有重要意义.
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白B1急性肺损伤启动子
- 不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞HMGB1表达的影响被引量：9
- 2009年
- 目的评价不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达的影响。方法雄性SD大鼠，周龄8～12周，体重270～320g，放血处死后，收集支气管肺泡灌洗液，分离、培养和传代肺泡巨噬细胞。将细胞接种于6孔培养板中，细胞浓度10^5／ml，培养48h后，随机分为5组（11=6），对照组（C组）不施加机械牵张应力；S1-4组分别施加5％、10％、15％和20％机械牵张应力，牵张频率30次／min，牵张时间24h。采用RT-PCR法测定HMGB1 mRNA表达；采用Westemblot方法测定HMGB1表达。结果肺泡巨噬细胞给予机械牵张应力后，HMGB1及其mRNA表达随机械牵张应力的增大而上调（P〈0．05或0．01）。结论大鼠肺泡巨噬细胞HMGB1的表达与机械牵张应力呈强度依赖性。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：HMGB1蛋白
- 机械牵张诱导肺泡巨噬细胞的细胞因子表达谱及其与脂多糖对MIP-2释放的协同效应被引量：9
- 2009年
- 目的观察机械牵张诱导肺泡巨噬细胞（AM）的细胞因子表达谱，以及机械牵张对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）表达的影响。方法用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测机械牵张诱导AM15种细胞因子的水平变化；检测不同强度机械牵张（5％、10％、15％和20％）和牵张刺激（20％）后不同时间点（0、1、3、6、12和24h）AM分泌MIP-2的水平，以及机械牵张（20％）与LPS（10ng／mL）共同刺激对AM分泌MIP-2的影响。结果牵张刺激后AM分泌IL-1β、IL-6、MIP-2、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、IFN-γ和干扰素诱导蛋白10（IP-10）的水平明显升高（P均〈0．001）。机械牵张以强度和时间依赖方式诱导MIP-2的分泌，随着牵张强度的增加（10％、15％和20％），MIP-2的分泌水平也明显增加（P均〈0．001）；在刺激后6～24h范围内MIP-2水平持续升高（P〈0．001）。以机械牵张和LPS共同刺激AM，MIP-2的生成量大大增加，二者存在协同效应（F=121．983，P〈0．001）。结论机械牵张可诱导AM释放多种细胞因子，机械牵张诱导MIP-2的上调具有强度和时间依赖性，并协同LPS诱导AM释放MIP-2，可能在呼吸机所致肺损伤的发生和发展中起重要作用。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：机械牵张肺泡巨噬细胞细胞因子呼吸机所致肺损伤
- 人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选
- 2010年
- 目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：高迁移率族蛋白质类细菌噬菌体肽库谷胱甘肽转移酶
- 针对大量噬菌体展示短肽序列的生物信息学分析策略的构建被引量：1
- 2008年
- 目的建立一种生物信息学分析预测方法，针对通过噬菌体展示技术获得的大量短肽信息，从中筛选出所需的目的功能蛋白。方法对应用噬菌体展示技术筛选脂多糖刺激的人外周血单核巨噬细胞株（THP-1）细胞获得的1263个七肽序列进行去冗余分析，结合混洗算法和随机排列检验（RPT），统计非冗余七肽序列中特定三肽的丰度及其显著性。利用Clustal W软件对包含丰度具有显著性的三肽的七肽序列进行多序列比对分析，并根据氨基酸的性质，寻找特征性短肽，通过在线BLAST软件与SWISS～PROT蛋白序列数据库进行同源性分析，获得包含这些特征性短肽的已知蛋白，进一步应用SignalP和TMHMM软件预测其中的分泌蛋白和膜蛋白，并最终获得候选蛋白。结果得到TNF—α、toll样受体6（TLR-6）等炎性反应相关的细胞因子和膜蛋白及其表位模拟肽，为脓毒症等炎性反应相关疾病的研究和治疗提供依据。结论建立了一种生物信息学分析预测方法，该策略的建立为通过噬菌体展示技术筛选得到的短肽序列的分析提供一个全新的平台。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：噬菌体展示生物信息学短肽分子模拟
- P38及上游激酶MKK6对周期性牵张应变诱导的肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1表达的调控被引量：19
- 2009年
- 本文旨在探讨P38及其上游激酶——丝裂原活化蛋白激酶激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase6,MKK6)对周期性牵张应变诱导的大鼠肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)表达的调控作用。应用DOTAP脂质体介导的基因转染方法将P38α的显性无活性突变体P38(AF)+pGFP以及MKK6b的组成性活性突变体MKK6b(E)+pGFP分别导入大鼠肺泡巨噬细胞,以质粒pcDNA3+pGFP作为阴性对照,以pGFP作为空白对照。应用荧光显微镜和Western blot方法观察转染基因的表达情况。建立体外大鼠肺泡巨噬细胞周期性牵张应变模型,观察各组细胞在施加20%周期性牵张应变时P38激酶活性变化,HMGB1蛋白和mRNA的表达变化情况。荧光染色及Western blot检测结果显示,外源基因成功转染大鼠肺泡巨噬细胞,并在细胞内表达。在大鼠肺泡巨噬细胞周期性牵张应变模型中观察到,MKK6b(E)转染细胞内P38激酶活性明显升高,而P38(AF)转染细胞内P38激酶活性显著下降;MKK6b(E)基因转染可促进牵张应变(应变幅度为20%)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达,而p38(AF)基因转染则抑制牵引应变诱导的HMGB1蛋白和mRNA表达。本研究表明,周期性牵张应变通过MKK6-P38α信号通路调节大鼠肺泡巨噬细胞HMGB1的表达。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：P38丝裂原活化蛋白激酶肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1
- 异丙酚对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1启动子转录活性的影响被引量：5
- 2010年
- 目的探讨异丙酚对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGBI）启动子转录激活的影响。方法以基因重组技术将HMGBI启动子克隆人荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic，得到重组质粒pGt3-HMGB1P，采用脂质体介导的转染技术将质粒转染AM细胞。根据转染质粒和施加刺激的不同分为以下各组：未转染组；转染pGL3-Basic组；转染pGL3-HMGB1P组；转染pGL3-HMGB1P＋IPS（100mg／L）刺激组；转染pG13-HMGB1P＋IPS（100mg／L）＋异丙酚（5mg／L）处理组。通过检测荧光素酶活性来观察启动子活性变化，分别采用Western blot和RT-PCR方法检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达。应用单因素方差分析进行不同组别间的比较。结果酶切和测序结果证实重组体pGt3-HMGB1P构建正确，荧光素酶活性检测显示pGL3-HMGB1P在AM细胞中有效表达。与转染pGL3-HMGB1P组比较，转染pGL3-HMGB1P＋LPS刺激组HMGB1启动子的转录活性（423±27），HMGB1蛋白（0．49±0．03）和mRNA（0．48±0．04）的表达均显著增加（P〈0．05）；与转染pGL3．HMGB1P＋LPS刺激组比较，转染pGL3．HMGB1P＋LPS＋异丙酚处理组HMGB1动子的转录活性（207±13），HMGB1蛋白（0．17±0．02）和mRNA（0．13±0．02）的表达均显著降低（P〈0．05）。结论异丙酚在转录水平通过抑制LPS诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：异丙酚脂多糖高迁移率族蛋白B1肺泡巨噬细胞转录活性启动子
- 盐酸戊乙奎醚对大鼠呼吸机所致肺损伤的保护作用及其机制被引量：2
- 2013年
- 机械通气是抢救危重症患者的重要手段，更成为急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）治疗的革命性进步，但其本身亦可引发或加重肺损伤，即呼吸机所致肺损伤（ventilator—inducedlunginjury，VILI）[1-3]。研究发现，“晚期”炎症介质高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGBl）参与了VILI的发病过程H0。盐酸戊乙奎醚（penehyclidine hydrochloride，PHC）是我国自主研发的新型选择性莨菪类药物，因对M胆碱受体的高选择性，心血管不良反应小，大大拓宽了其临床应用，除了用于抢救有机磷中毒和麻醉术前给药外，PHC还具有改善微循环、抑制炎症反应、降低毛细血管通透性等作用，被应用于ALI的治疗，但其对VILI的保护作用及其机制尚未见报道[5]本研究通过复制VILI大鼠模型，观察不同剂量PHC对VILI大鼠肺组织的保护作用以及对HMGBl蛋白和mRNA表达的影响，并探讨其细胞信号调节机制。
- 丁宁肖慧许立新佘守章
- 关键词：呼吸机所致肺损伤盐酸戊乙奎醚大鼠模型高迁移率族蛋白心血管不良反应
- MKK6p38α信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞表达晚期糖基化终末产物受体中的作用被引量：4
- 2009年
- 目的探讨p38α及其上游激酶丝裂素活化蛋白激酶6（MKK6）在机械牵张诱导肺泡上皮细胞（A549）表达晚期糖基化终末产物受体（RAGE）中的作用。方法应用阳离子脂质体DOTAP介导的基因转染方法将p38a显性无活性突变体p38α（AF）＋绿色荧光表达载体pGFP及MKK6b的组成性活性突变体MKK6b（E）＋pGFP分别导入A549细胞，以质粒pcDNA3＋pGFP作为阴性对照。以pGFP作为空白对照。应用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测转染基因。建立体外细胞牵张应变模型，观察各组细胞在施加20％牵张应变时p38激酶活性变化及RAGE的蛋白和mRNA表达变化。结果Western blotting检测结果显示，外源基因成功转染A549细胞，并在细胞内表达。在A549细胞牵张应变模型中观察到，MKK6b（E）转染细胞内p38激酶活性明显升高，而p38a（AF）转染细胞内p38激酶活性显著下降；MKK6b（E）基因转染可促进20％牵张应变诱导A549细胞RAGE的蛋白和mRNA表达，而p38α（AF）基因转染则抑制牵引应变诱导的RAGE蛋白和mRNA表达。结论牵张应变通过MKK6p38α信号通路调节A549细胞RAGE的表达。
- 丁宁肖慧许立新余守章
- 关键词：机械牵张肺泡上皮细胞P38丝裂素活化蛋白激酶晚期糖基化终末产物受体
- p38信号通路参与呼吸机所致肺损伤大鼠高迁移率族蛋白B1的表达被引量：5
- 2009年
- 目的 研究p38信号通路在呼吸机所致肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）大鼠肺组织表达高迁移率族蛋白B1（highmobility group box 1 protein，HMGB1）中的作用。方法健康SD大鼠24只随机分为3组：对照组（A组）不行机械通气，保留自主呼吸；常规通气组（B组）潮气量（Vt）为8mL／kg；大潮气量通气组（C组）Vt为40mL／kg。机械通气4h后处死动物，测定支气管肺泡灌洗液中总蛋白水平、白细胞计数以及肺湿干重比值（W／D）和中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）活性。采用Western blot方法检测肺组织HMGB1蛋白和D38激酶活性变化，采用RT-PCR方法检测HMGB1 mRNA的表达。应用单因素方差分析进行不同组别间的比较。结果通气4h后，与A组相比，C组总蛋白水平（1．77±0．68）g／L、白细胞计数（106．55±28．17）×10^7L^-1、肺W／D比值（7．16±1．02）、MPO活性（3．94±1．21）U／g、HMGB1蛋白（0．64±0．17）和mRNA（1．17±0．45）表达以及p38激酶活性（0．514-0．12）均明显增加（P〈0．05），而B组上述各项指标的变化均无统计学意义（P〉0．05）。结论大潮气量机械通气可引起大鼠急性肺损伤，p38参与了机械牵张诱导肺组织HMGB1的表达。
- 丁宁肖慧高巨许立新佘守章
- 关键词：机械通气急性肺损伤高迁移率族蛋白B1P38丝裂原活化蛋白激酶
