张渝英
- 作品数：10 被引量：40H指数：4
- 供职机构：中国科学院微生物研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达被引量：12
- 1991年
- 以Tac为启动子构建了牛凝乳酶原B基因表达质粒pTaAC,转化大肠杆菌JM105,对数生长期加入0.1mmol/L IPTG能明显诱导凝乳酸原的产生。基因表达除受IPTG的影响外,也受温度的调节控制。在30℃培养,IPTG存在时,凝乳酶原产量极低;在42℃无IPTG的条件下,基因也能表达。按电泳扫描计算凝乳酶原蛋白占细胞可溶性总蛋白量的12—19%,按ELISA法测定凝乳酸原产量为80—100mg/L,经变性、复性及酸化有活性的凝乳酶产量为14—20mg/L。
- 张渝英周炜刘年娟杨开宇
- 关键词：基因表达
- 蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A的表达及性质的研究被引量：1
- 2004年
- 克隆了AspergillusnigerT2 1中的蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A(PRPA)基因 ,并将它插入pET2 3b表达载体。在E .coli中表达时 ,PRPA占菌体总蛋白的 34%。经过超声破细胞、硫酸铵分级沉淀和离子交换层析获得了纯度大于 90 %的重组蛋白。PRPA有二硫键异构酶活性。在PRPA存在下 ,变性和还原的溶菌酶复性率和复性速度降低 ,电泳结果表明溶菌酶聚集增多。
- 周海平贾翠娟张渝英
- 腾冲嗜酸热两面菌S5分子伴侣β亚基的表达、纯化和活性的初步分析被引量：1
- 2007年
- 用NdeI和BamHI酶切回收腾冲嗜酸热两面菌S5的分子伴侣β亚基基因片段插入pET-23b的相应位置,并分别在BL21(DE3)和Rosetta-gami^(TM)B(DE3)pLysS中表达。表达的β亚基以可溶的形式存在。β亚基在Rosetta-gami^(TM)B(DE3)pLysS中表达较高,其占菌体总蛋白的16．2%,且以单体和聚体形式同时存在。表达的菌体经超声破碎、70℃热处理后,上清中β亚基蛋白含量达到30%,再经(NH_4)_2SO_4沉淀、Bio-Gel A-1．5m和DEAE-Sepharose CL-6B柱层析,得到在SDS-PAGE呈电泳均一的β亚基,Native-PAGE表明其为聚体,有弱的ATPase活性。
- 马晴张渝英
- 关键词：分子伴侣Β亚基ATPASE
- 大肠杆菌中表达外源基因的质粒和牛凝乳酶原的生产方法
- 本发明提供了一种用于在大肠杆菌中表达外源基因的重组质粒，它具有：启动子-AAGCATTGGTTAAAAATTAAGGAGGAA TTAAAAAATG-牛凝乳酶源基因；或者，启动子-AAGCATTAACTTTAAAAATT...
- 杨开宇刘年娟张渝英
- 文献传递
- 凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析被引量：4
- 1998年
- 为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β转角的功能，利用基因突变技术，将该转角的氨基酸残基（Ｌｅｕ２０Ｇｌｙ２１Ｔｈｅ２２Ｐｒｏ２３Ｐｒｏ２４Ｇｌｎ２５）改为（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＧｌｙＧｌｎ２５）、（Ｌｅｕ２０ＳｅｒＧｌｙＧｌｎ２５）或（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＳｅｒＧｌｎ２５），得到３个突变牛凝乳酶原表达质粒ｐＭＣＧＧ，ｐＭＣＳＧ和ｐＭＣＧＳ。除ｐＭＣＧＳ不能在大肠杆菌中表达外，ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ均能以包含体的形式进行表达，且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样，ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ的表达产物经过变性复性，均能自活化为假凝乳酶，而且复性后的酶原突变体在ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ上的柱行为与野生型相类似，但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小，但对酶的催化效率影响较大。
- 黎红晔张渝英董贻诚杨开宇
- 关键词：凝乳酶突变体
- 提高重组牛凝乳酶原的表达与复性的方法
- 牛凝乳酶原的高效表达与复性方法属于微生物和酶的技术领域。为提高重组凝乳酶生产中基因表达水平及复性率，本发明采用高效表达质粒可使牛凝乳酶原在大肠杆菌中表达量占细胞总蛋白的30-40％，采用优化的溶解包含体及再折叠的工艺可使...
- 杨开宇刘年娟张渝英
- 文献传递
- 蛋白质的氧化重折叠被引量：12
- 2003年
- 经过近几十年来广泛而深入的研究 ,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。 1 在已研究过的蛋白质中 ,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠 ,这与折叠能量景观学说是一致的。 2 正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂 (BPTI)折叠中所起的重要作用并非相互排斥 ,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需 ,与控制肽链折叠无直接关系。 3 根据对BPTI的研究 ,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用 ,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明 ,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成 ,更具有普遍意义。 4 在氧化重折叠的早期 ,二硫键的形成基本上是一个随机过程 ,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外 ,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述 ,在折叠的后期 。
- 张渝英杨开宇
- 关键词：二硫键重组蛋白质
- 凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变被引量：7
- 2001年
- 在对凝乳酶原二硫键Cys2 0 6 Cys2 10进行定位突变过程中发现 ,在相应的模板序列中有自身形成自由能为 - 16 1kcal/mol的茎环结构倾向 ,妨碍与引物结合 ,从而难以合成突变的DNA ,采用快退火可解决此矛盾。 5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达 ,除C2 0 6A外 ,约占细胞总蛋白的 5 0 %左右。突变体的复性结果表明 ,Cys2 0 6 Cys2 10对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的 ,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响 ,在 5个突变体中 ,C2 0 6A/C2 10A的复性率分别为C2 0 6S/C2 10S、C2 10A、C2 10S的 4 5倍、2 0倍和 30倍 ,而C2 0 6A完全不能复性。C2 0 6A/C2 10A与C2 0 6S/C2 10S的远紫外CD光谱与野生型基本相同 ,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变 ,而荧光强度有显著增加。由于上述 3个蛋白具有相同比活 ,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象 ,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。
- 陈红杰潘学峰张国宝刘年娟张渝英杨开宇
- 关键词：定位突变二硫键凝乳酶原凝乳酶蛋白质构象
- 反向PCR方法克隆腾冲嗜酸两面菌的分子伴侣基因被引量：2
- 2005年
- 根据已知的Sulfolobus属的分子伴侣基因,设计简并引物,用PCR的方法从腾冲嗜酸两面菌(Acidianus tengchongensis)基因组DNA中分别克隆到了分子伴侣α亚基和β亚基的约500bp的基因片段。以它们为探针进行Southern杂交,确定了合适的限制性内切酶。以确定的限制性内切酶消化的基因组DNA环化物为模板,进行反向PCR反应,引物的延伸方向由已知序列出发沿环化分子向未知区域进行,扩增产物经测序表明为α亚基和β亚基基因。根据所得序列分别设计两对引物进行PCR,测序结果表明得到了α亚基和β亚基的完整基因。
- 马晴张渝英
- 关键词：反向PCR分子伴侣
- 碱性条件下溶解包涵体提高凝乳酶原复性率的机制被引量：6
- 1997年
- 重组凝乳酶原的复性效率不仅依赖于复性条件,而且与包涵体的溶解条件(即变性条件)有关.含有凝乳酶原的包涵体在pH11,8mol/L脲中溶解后,其复性率较在pH8,8mol/L脲中溶解的可提高1倍,由20%左右提高到40%左右.其机制是碱性条件有利于破坏分子间交联的二硫键从而增加凝乳酶原的溶解度.更为重要的是碱性条件使凝乳酶原分子处于一种还原性更强更为伸展的状态,这种状态容易进行正确再折叠.
- 张治洲张渝英杨开宇
- 关键词：凝乳酶原复性包涵体
