李长文
- 作品数：10 被引量：33H指数：3
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC转染骨髓基质细胞的条件优化被引量：3
- 2006年
- 目的 优化新型靶向性非病毒基因载体——含RGD肽K16GRGDSPC介导转化生长因子β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞的转染条件。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。在保持其它因素一致的条件下，通过变化单一因子来筛选某个最佳参数。结果 合成肽与设计肽的分子量一致，纯度为94％～95％，满足实验要求。在寡肽载体介导转染的过程中，溶酶体抑制剂氯喹起着不可或缺的作用，而且在氯喹溶液中的暴露时间至少应维持在8h以上；在载体／DNA复合物中暴露时间过短（〈4h）或过长（〉24h）对转染都有不利影响；血清对载体／DNA复合物与细胞的结合有明显抑制作用；质粒含量在2～4μg时转染效果最佳；质粒／载体质量比为1：2～1：4时有较高的转染效率；加入转铁蛋白也能显著提高基因的转染和表达，且在25μg时转染效率达到最大。结论 通过优化转染条件可提高寡肽载体的转染效率，可为下一步进行骨基质材料表面基因修饰研究提供基础。
- 潘海涛郑启新郭晓东刘勇李长文宋玉林
- 关键词：转染
- 新型靶向性非病毒基因转移载体K16GRGDSPC介导基因转染的实验研究
- 2006年
- 目的构建一种新型靶向性非病毒基因转移载体-含RGD肽K16GRGDSPC(记作K16-RGD),评价其介导外源基因转染骨髓基质干细胞的可行性和靶向特异性。方法固相合成法合成K16-RGD,以其为载体将虫荧光素酶质粒导入兔骨髓基质干细胞,检测其转染效率;并观察溶酶体抑制剂氯喹和聚乙烯亚胺(PEI)对其转染效率的影响。通过细胞黏附竞争性抑制和转染竞争性抑制实验检测K16-RGD介导转染的靶向特异性。结果K16-RGD的转染效率低于商业化脂质体,但加入氯喹可使其转染效率与脂质体相近。PEI也能显著提高K16-RGD的转染效率。含RGD肽GRGDSPC、K16GRGDSPC能显著抑制BMSCs的黏附和降低K16-RGD的转染效率。结论K16-RGD是一种易于合成、高效、低毒的新型靶向性非病毒基因转移载体,以其作为载体介导外源基因转染骨髓基质干细胞是可行的,为下一步构建载基因仿生基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础。
- 潘海涛郑启新郭晓东刘勇李长文宋玉林
- 关键词：基因转移技术骨髓祖代细胞丝氨酸天冬氨酸
- 转化生长因子-β基因转染骨髓基质干细胞在多肽修饰的聚乳酸-羟基乙酸上生长情况的研究
- 2008年
- 目的探讨转转化生长因子-β（TGF-β）基因的骨髓基质干细胞（BMSCs）在RGD多肽表面修饰的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）材料上的增殖、黏附、分化情况，以研究TGF-β基因和RGD多肽在调控种子细胞生物学行为方面的作用。方法将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上，把TGF-β基因转入BMSCs，以单纯PLGA支架材料、单纯BMSCs作为对照，分别将单纯BMSCs和转TGF-β基因BMSCs两组细胞种植于两种材料上，培养1、2、3d后，计数细胞密度以反映细胞增殖情况；接种后4、12h，沉淀法定量检测黏附的细胞数；培养24h后用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色，观察细胞骨架的组织情况；用成骨性培养基培养7、14、21d，检测细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性来了解BMSCs分化情况。结果转TGF-β基因细胞密度显著增大，且在各时间点有较高的ALP活性。RGD多肽修饰的PLGA材料上细胞黏附率高，并有较高的荧光素密度及较粗大的细胞骨架，且在第14天时表现出高的ALP活性。结论TGF-β基因和RGD多肽同时应用有利于BMSCs黏附到支架材料上，并能促进其增殖和向成骨细胞方向分化。
- 李长文郑启新郭晓东全大萍赵洁
- 关键词：TGFΒ骨髓细胞
- 靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽的合成及转染骨髓基质干细胞的研究被引量：2
- 2006年
- 目的设计合成新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽,探讨其作为载体介导外源基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的可行性。方法用固相合成法合成K16GRGDSPC并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。以其作为载体转染增强型绿色荧光蛋白质粒pcDNA3-EGFP并计数转染效率；转染转化生长因子(TGF)-β1质粒pcDNA3-TGF-β1并通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和TGF-β1敏感细胞株水貂肺上皮细胞(MV1)生长抑制法检测目的基因TGF-β1稳定表达情况及表达产物的生物学活性。结果质谱图显示合成肽的平均分子量为2741．3307 m/z,与理论上计算的平均分子量一致。高压液相色谱仪示合成肽的纯度为94%～95%,满足试验需求。以K16GRGDSPC寡肽为载体转染BMSCs的效率为(18．6±2．1)%,与脂质体(Lipofectamine)介导转染的效率(19．3±2．3)%差异无统计学意义(P＞0．05)；转染TGF-β1基因阳性细胞克隆经RT- PCR扩增有特异性产物,TGF-β1敏感细胞株MV1的增殖受到明显抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。结论所合成的肽是设计的K16GRGDSPC寡肽,以其为载体介导外源基因转染BMSCS是确实可行的,为下一步构建载基因仿生基质材料奠定了基础。
- 郭晓东潘海涛郑启新杨述华邵增务刘勇李长文宋玉林袁泉
- 关键词：非病毒载体肽类骨髓基质干细胞
- RGD多肽修饰的改性PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附性影响的研究被引量：3
- 2005年
- 目的了解精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD多肽)修饰是否能提高改性的PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞的粘附性。方法用异型双功能交联剂SulfoLCSPDP将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,以未接多肽的改性PLGA材料做对照,取第三代MSC接种到材料上,培养4、12小时后沉淀法定量检测粘附的细胞数,培养24小时后摄光镜图像比较粘附细胞的数量和形态。结果培养4、12小时后实验组细胞粘附率分别为0.17±0.01、0.38±0.02,均极显著高于对照组的0.08±0.01、0.14±0.01(P<0.01),且24小时后细胞的粘附质量也较对照组为好。结论RGD多肽修饰的确能提高改性PLGA支架材料对骨髓间充质干细胞的粘附性。
- 李长文郑启新郭晓东全大萍赵洁
- 关键词：细胞粘附生物材料表面修饰RGD多肽PLGA
- 含RGD肽基因导入系统介导TGFβ_1基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达与稳定表达被引量：4
- 2006年
- 目的评价含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(简记作K16-RGD)作为新型基因转染载体的可行性,并探讨转化生长因子β1(TGFβ1)基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达能力。方法固相合成法合成K16-RGD。以6μgK16-RGD:2μgpcDNA3-TGFβ1(pTGFβ1)比例转染第三代兔BMSCs,转染72h后通过免疫组织化学染色和图像分析检测TGFβ1的瞬时表达水平;G418筛选2周形成阳性克隆,扩大培养后同法检测TGF-β1的稳定表达水平。通过酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测TGF-β1的表达分析转染的量效关系和时效关系。结果瞬时转染组免疫组化部分细胞呈强阳性,稳定转染组几乎全部细胞呈强阳性并且持续表达4周以上。图像分析显示瞬时转染组和稳定转染组TGF-β1的表达均比对照组显著增强(P<0·01),且稳定表达组明显高于瞬时表达组(P<0·05)。ELISA法检测量效关系显示,转染体系中K16-RGD(μg)∶pTGFβ1(μg)为3∶1时TGFβ1有最高的表达效率;时效关系显示,稳定转染组TGFβ1的表达比瞬时表达组高(P<0·05)。结论含RGD肽基因导入系统K16-RGD作为基因转染载体是可行的,TGFβ1基因转染BMSCs可有效表达TGFβ1,为下一步利用K16-RGD作为载体构建载TGFβ1基因骨基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础。
- 潘海涛郑启新郭晓东刘勇李长文
- 关键词：TGFΒ1基因转染骨髓基质干细胞
- 原位胶原凝胶对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响
- 2009年
- 目的研究脊髓损伤后原位形成胶原凝胶对神经功能恢复的影响。方法15只健康雌性SD大鼠随机分为胶原组、对照组和假手术组．Allen撞击法制作脊髓损伤模型。用微量注射器将胶原溶液注入损伤部位，在体温作用下让其原位形成凝胶，对照组注入PBS溶液，每周进行运动评分，6周后取脊髓组织进行免疫荧光染色，观察损伤部位的胶质瘢痕和轴突生长情况。结果胶原组大鼠第5周起BBB评分显著高于对照组，免疫荧光显示损伤部位胶质瘢痕少于对照组，且长入损伤部位的轴突也多于对照组。结论原位形成的胶原凝胶能抑制损伤部位胶质瘢痕的形成，并能促进轴突再生长入损伤部位。证明胶原是一种较好的能用于修复脊髓损伤的可注射材料。
- 李长文郑启新吴永超郭晓东李景峰
- 关键词：胶原脊髓损伤轴突再生胶质瘢痕
- RGD多肽修饰的改性PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附、增殖及分化影响的研究被引量：18
- 2006年
- 目的:探索RGD多肽修饰的改性PLGA支架材料上骨髓基质细胞的增殖、粘附及分化情况。方法用异型双功能交联剂Sulfo-LC-SPDP将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,以未接多肽的改性PLGA材料做对照,取第三代MSC接种到材料上,培养1d、2d、3d、4d后比较材料上的细胞密度来反映细胞的增殖程度;取第三代MSC接种到材料上,培养4h、12h后沉淀法定量检测粘附的细胞数,培养24h后摄光镜图像比较粘附细胞的数量和形态,并用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色,在荧光显微镜下观察细胞骨架的组织情况;取第三代MSC接种到材料上,用成骨性培养基培养7d、14d、21d,检测细胞中ALP活性来了解MSC分化情况。结果:培养1d、2d、3d、4d后细胞的增殖程度无显著性差异;培养4h、12h后实验组细胞粘附率均显著高于对照组,且24h后细胞的粘附质量、细胞骨架的组织情况也较对照组为好;培养14d后实验组细胞表达显著高的ALP活性。结论:RGD多肽修饰对细胞增殖无明显促进作用,但能提高改性PLGA支架材料对骨髓基质细胞的粘附性,对MSC向成骨细胞分化有显著促进作用。
- 李长文郑启新郭晓东全大萍赵洁
- 关键词：仿生材料表面修饰RGD多肽PLGA
- 骨形态发生蛋白-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨对骨髓基质干细胞生物学行为的影响被引量：2
- 2008年
- 目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料对骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖、黏附及分化等生物学行为的影响。方法制备重组胶原矿化骨支架材料，将BMP-2活性多肽通过交联剂共价结合到材料上，扫描电镜观察支架材料表面微观形貌；取第3代BMSCs接种到材料上，以未结合多肽的重组胶原矿化骨作为对照，采用MTT法检测BMSCs在材料表面的增殖；沉淀法检测BMSCs在材料表面的黏附率；扫描电镜观察比较BMSCs在材料表面的生长形态；通过检测细胞中的碱性磷酸酶活性及钙含量，观察BMSCs在材料表面的分化情况。结果扫描电镜结果显示：支架材料呈多孔状；X射线光电子能谱法证实BMP-2活性多肽成功共价结合到材料表面；BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料表面BMSCs的黏附和向成骨细胞方向分化能力均高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），而BMSCs的增殖能力与对照组相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论BMP-2活性多肽可以显著改善重组胶原矿化骨复合材料的细胞相容性和生物活性，经BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料是一种理想的骨组织工程支架材料。
- 吴斌郑启新郭晓东吴永超李长文潘海涛王玉崔福斋
- 关键词：骨形态发生蛋白质类生物材料干细胞
- 转铁蛋白增强靶向性非病毒载体K16GRGDSPC介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达被引量：1
- 2006年
- 目的:检测转铁蛋白能否增强新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达,优化寡肽载体的转染条件,为下一步利用寡肽载体构建载基因基质材料进行骨缺损修复提供实验依据。方法:实验于2004-10/2005-01在协和医院骨科实验室完成。①用固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。②新西兰大白兔麻醉后无菌条件下自股骨大转子处抽取骨髓2mL,1500g离心收集细胞,加入含体积分数0.2新生牛血清的DMEM混悬细胞于培养瓶中常规培养。48h后更换培养基,除去未贴壁细胞,细胞生长至85%融合后传代。③应用转化生长因子真核表达载体pcDNA3-TGFβ1和增强型绿色荧光蛋白真核表达载体pcDNA3-EGFP,观察转铁蛋白对K16GRGDSPC寡肽介导上述两种质粒转染骨髓基质干细胞的转染及表达效率的影响。结果:①寡肽的分子量和纯度检测:质谱图显示肽平均分子质量为2741.3307m/z,与理论上计算设计合成肽的平均分子质量一致,高压液相色谱仪示合成肽的纯度为94%～95%。②转铁蛋白、寡肽载体、质粒DNA三者形成复合物的电泳鉴定结果:将1μg寡肽载体分别与10μg或20μg转铁蛋白及2μgpcDNA3-TGFβ1混合后电泳,结果显示三者混合物的电泳迁移率均低于不加转铁蛋白的空白对照,且加20μg转铁蛋白较加10μg转铁蛋白的电泳迁移率更低。说明带正电荷的转铁蛋白与寡肽载体和质粒DNA形成了复合物。③转铁蛋白增加K16GRGDSPC寡肽转染效率:2μgpEGFP质粒与6μgK16-GRGDSPC寡肽加5～45μg转铁蛋白转染骨髓基质干细胞,转染效率随转铁蛋白浓度的增加而逐步提高,在25μg时转染效率达到最大,进一步增高转铁蛋白浓度,转染效率并不增加。④转化生长因子β1活性检测结果:体外以6μgK16GRGDSPC寡肽加25μg转铁蛋白介导2μgpcDNA3-TGFβ1转染骨髓基质干细胞,转染72h后测得�
- 潘海涛郑启新郭晓东刘勇李长文宋玉林
- 关键词：肽类遗传学转铁蛋白转染
