汤彦翀
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
- 供职机构：南京农业大学食品科技学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划江苏省自然科学基金江苏省高技术研究计划项目更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与原核表达被引量：3
- 2009年
- 脂肪酶是重要的工业用酶,在食品加工、生物柴油的合成等领域具有广泛的应用。但是在应用中有机溶剂对脂肪酶具有一定的毒性,因此获得耐有机溶剂的脂肪酶基因并实现高效表达是脂肪酶规模化应用的前提。本研究应用PCR技术首次从耐有机溶剂脂肪酶产生菌腐生葡萄球菌M36基因组DNA中扩增得到脂肪酶Ⅲ基因lip3(GenBank AccessionNo.FJ979867),其编码区长度为741bp,编码247个氨基酸,推测蛋白分子量大小为31.6kD。它与腐生葡萄球菌lip3推测的基因(GenBank AccessionNo.AP008934)只有83%的同源性。将该基因与大肠杆菌表达载体pET-DsbA连接,转化大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-DsbA-lip3,在pH8、25oC条件下,OD600为1.0时用0.4mmol/LIPTG诱导12h酶活达到25.8U/mL。重组酶在甲醇、正己烷、异辛烷、正庚烷等有机溶剂中具有较好的耐性。lip3基因的克隆及在大肠杆菌中有效表达的研究为进一步进行基因工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。
- 汤彦翀卢亚萍吕凤霞别小妹郭瑶陆兆新
- 关键词：腐生葡萄球菌基因克隆原核表达
- 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达
- 生物柴油是生物质能的一种形式，具有绿色、可再生、能耗低等优点，能够缓解石油即将枯竭和环境污染对人类造成的危机，成为国内外重点研究开发的热点。与传统的化学催化法相比，脂肪酶法合成生物柴油条件温和、工序简单、能耗低、绿色环保...
- 汤彦翀
- 关键词：腐生葡萄球菌脂肪酶基因克隆定点突变
- 文献传递
- 普通变形杆菌位置非特异性脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达被引量：1
- 2010年
- 【目的】本文拟克隆普通变形杆菌(Proteus vulgaris)脂肪酶基因,并实现其在大肠杆菌中的高效表达,并检验外源表达脂肪酶的催化性质。【方法】通过PCR方法,从P.vulgaris基因组中扩增其脂肪酶基因(PVL),并将其开放读码框区域连接到表达载体pET-DsbA及pMBP-P上,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达。我们对培养基组分及培养条件进行优化,以获得最高的酶产量。用Ni柱亲和层析法对所得重组脂肪酶进行纯化,并考察其酶学性质。【结果】PVL基因编码区含864个碱基,编码含287个氨基酸的酶蛋白。该序列在GenBank的登录号为FJ643627。PVL基因在大肠杆菌BL21内诱导表达的最佳条件为:在pH8.5的LB培养基中添加15g/L葡萄糖及200mg/L氨苄青霉素,在培养至OD600为1.2时加入100mg/LIPTG,15℃诱导15h,最高酶活达到192.2U/mL。通过亲和层析纯化了重组脂肪酶,得到一个约31kDa的蛋白条带。外源表达的脂肪酶的催化特性与野生菌脂肪酶相似,具有催化的位置非特异性,对长链脂肪酸酯亲和性最高。【结论】PVL基因在大肠杆菌中的高效表达为P.vulgaris脂肪酶的进一步研究与应用奠定基础。
- 卢亚萍顾菁汤彦翀吕凤霞别小妹陆兆新
- 关键词：PROTEUS基因克隆原核表达
- 内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I在大肠杆菌中融合表达及活性分析被引量：2
- 2010年
- 以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-I基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-I,经测序正确后,将PPFE-I基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-I的表达,表达产物酶活性达228IU/mL。表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%。Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-I融合蛋白。表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。
- 吕凤霞陆兆新别小妹林谦张充曹林郭瑶汤彦翀
- 关键词：内生菌纤溶酶
