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盖微微: 作品数：17 被引量：52H指数：5; 供职机构：军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室更多>>; 发文基金：公益性行业(农业)科研专项国家科技支撑计划中国博士后科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生农业科学更多>>

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狂犬病病毒CVS-11株全序列测定及其感染性克隆的构建被引量：1: 2013年; 【目的】测定狂犬病病毒标准攻击毒CVS-11株全基因组序列,构建CVS-11株全长cDNA感染性克隆。【方法】RT-PCR扩增CVS-11株全基因组得到有重叠的12个片段,分别克隆至平端载体pEASY-Blunt,测定CVS-11株全基因组核苷酸序列。用软件DNAMAN分析CVS-11全序列单一性酶切位点,设计引物,分4段扩增CVS-11全基因组,扩增产物经多步酶切、连接逐步插入至真核表达载体pcDNA3.1,获得全长质粒pcDNA3.1-CVS-11。pcDNA3.1-CVS-11与其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L、G共转染NA细胞,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定,拯救得到重组病毒rCVS-11。【结果】CVS-11全基因组序列由11 927个核苷酸组成,编码5个结构蛋白,结构基因排列同已知的其他狂犬病病毒一致。成功构建了CVS-11全长cDNA重组质粒pcDNA3.1-CVS-11和其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L和G。经共转染,成功拯救了重组病毒rCVS-11。【结论】CVS-11株感染性克隆的构建为从分子水平上进一步研究狂犬病病毒奠定了基础。; 薛向红郑学星盖微微梁红茹马金柱李岭王铁成冯娜黄耕赵永坤杨松涛夏咸柱; 关键词：狂犬病病毒全序列测定

马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备: 2017年; 原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。; 王琪盖微微闫飞虎冯娜吴芳芳赵梓淇曹增国李岭迟航金宏丽邱泊宁崔健男赵永坤王铁成高玉伟王化磊杨松涛夏咸柱; 关键词：马尔堡病毒多克隆抗体

新型狂犬病病毒中和抗体检测方法的建立: 2013年; 目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别采用荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定及电镜观察等方法对rHEP-eGFP病毒进行鉴定;分别绘制rHEP-eGFP和亲本毒株HEP-Flury的生长动力学曲线;将rHEP-eGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,测定各代次rHEP-eGFP的滴度,荧光显微镜下观察eGFP的表达;采用TCID50法检测狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11和rHEP-eGFP的毒力;以rHEP-eGFP病毒为抗原,建立新型荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibodyvirus neutralization,FAVN)-eGFP,对25份犬血清的抗体效价进行测定,并与标准FAVN检测结果进行比较。结果经荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定和电镜观察表明,成功拯救出rHEP-eGFP病毒;重组病毒rHEP-eGFP与亲本病毒HEP-Flury的生长特性相似;rHEP-eGFP连续传代9次,均能稳定表达eGFP;CVS-11的毒力为108TCID50/ml,rHEP-eGFP的毒力为107.3TCID50/ml;FAVN-eGFP与FAVN测定25份犬血清抗体效价的结果具有良好的一致性。结论建立的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVN-eGFP)准确度高,特异性好。; 薛向红郑学星盖微微李岭马金柱冯娜王铁成黄耕赵永坤杨松涛夏咸柱; 关键词：狂犬病病毒绿色荧光蛋白

埃博拉病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用被引量：3: 2016年; 为建立EBOV抗体间接ELISA检测方法,以纯化后的EBOV糖蛋白作为包被抗原,HRP标记山羊抗马IgG为二抗,EBOV阳性马血清和阴性马血清分别为阳、阴性对照,优化反应条件,以EBOV病毒样颗粒免疫获得的高免马血清评价其特异性和敏感性,并将检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相比较,进一步评价EBOV抗体ELISA检测方法在EBOV免疫血清抗体水平检测中的应用。优化后的间接ELISA方法可特异性检测EBOV抗体,与西尼罗病毒等的阳性血清均不发生反应,检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相平行。批内、批间试验变异系数均小于8%。本研究成功建立了EBOV抗体间接ELISA检测方法,为EBOV免疫血清抗体水平检测提供了一种简便、快速的检测方法。; 曹增国王化磊盖微微盖微微郑学星李岭金宏丽冯娜李岭王丽娜冯娜毕玉海赵永坤夏咸柱; 关键词：埃博拉病毒间接ELISA

MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定被引量：2: 2018年; 目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代。将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48h的sf9细胞进行IFA鉴定。结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212bp,与预期相符。重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确。重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确。IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达。SDSPAGE显示纯化的重组S1为单一100×103(Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别。结论成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础。; 胡星星邱泊宁迟航迟航王翀王化磊金宏丽王翀冯娜盖微微高玉伟金宏丽杨松涛黄培; 关键词：S1蛋白纯化

埃博拉病毒检测与分型Real-time PCR方法的建立被引量：16: 2013年; 目的建立一种致死性埃博拉病毒(EBOV)的快速检测与分型方法。方法根据苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因的保守区序列,设计一对通用引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释质粒pblue-SG,pblue-ZG为标准品,进行Real-time PCR扩增,制作标准曲线,并进行重复性、准确性检验及特异性检测。结果 Real-time PCR检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒标准曲线相关系数均大于0.99,灵敏度可达1.0×101拷贝,高于常规PCR方法的106～107;7种其他对照烈性病病原体检测均呈阴性。结论用建立的Real-time PCR方法检测埃博拉病毒快速、灵敏、特异,重复性好,为埃博拉出血热的快速确诊奠定了基础。; 盖微微郑学星薛向红高玉伟赵永坤王铁成王化磊黄耕冯娜杨松涛夏咸柱; 关键词：埃博拉病毒 REAL-TIME TAQMAN探针

犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定被引量：1: 2015年; 为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H,并将表达的重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应;以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,可见相对分子质量为63和68ku左右的条带,分别为重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH),大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达,且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。; 虞一聪冯娜闫飞虎盖微微王铁成王化磊郑学星赵永坤黄耕杨松涛高玉伟夏咸柱; 关键词：犬瘟热病毒融合蛋白血凝素蛋白

裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：3: 2014年; 目的建立一种快速、敏感、特异的Real-time PCR(实时荧光定量PCR)方法,用于裂谷热病毒(RVFV)的检测。方法根据裂谷热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0.99,灵敏度为1.0×101拷贝,高于常规PCR方法(1.0×103拷贝);除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批间重复的变异系数均小于1%。结论建立的裂谷热病毒Real-time PCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷热病毒感染快速诊断及流行病学调查。; 盖微微迟航迟航薛向红郑学星王化磊薛向红赵永坤高玉伟黄耕王化磊夏咸柱; 关键词：PCR TAQMAN探针

马抗中东呼吸综合征冠状病毒特异性F(ab’)_2的制备被引量：1: 2019年; 目的采用免疫亲和层析技术纯化制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)特异性IgG与F(ab’)_2。方法以经MERS-Co V病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,原核表达的MERS-CoV刺突蛋白S受体结合域(S-receptor binding domain,S-RBD)为抗原蛋白制备免疫亲和柱,提取制备抗原特异性IgG或F(ab’)_2。间接ELISA法检测各样品的活性,MERS假病毒中和试验检测样品的中和活性,BCA法测定样品的浓度,并计算收率。结果所制备的特异性IgG与特异性F(ab’)2的纯度分别为90. 1%和92. 8%,收率分别为8. 7%和3. 07%;在相同的浓度下,所制备的特异性IgG或F(ab’)_2的活性和中和活性均高于对照组中的血清总Ig G或总F(ab’)_2。结论成功制备了马抗MERS-CoV特异性IgG或F(ab’)_2,为建立更加安全与高效的抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2制备工艺奠定了基础。; 邱泊宁胡星星闫飞虎王翀崔健男盖微微盖微微王化磊曹增国王化磊夏咸柱; 关键词：冠状病毒病毒样颗粒免疫球蛋白

马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究: 马尔堡出血热（MHF）是由马尔堡病毒（MARV）引起的一种急性、烈性出血性人兽共患传染病,目前尚无有效的疫苗和治疗药物。此外,由于MARV属于生物安全四级病原体,进一步阻碍了其传统疫苗的研发。因此,研制安全、有效的新型疫...; 盖微微; 关键词：马尔堡病毒病毒样颗粒中和抗体; 文献传递

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