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刘靖华: 作品数：60 被引量：209H指数：7; 供职机构：南方医科大学基础医学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划广东省自然科学基金更多>>; 相关领域：生物学医药卫生农业科学文化科学更多>>

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基于甲基化反应系统检测SETD3甲基化组蛋白的位点: 2017年; [目的]构建pEGX-4T-1-Setd3,表达并纯化GST-SETD3蛋白;用获得的蛋白进行体外甲基化反应并鉴定其活性,建立体外甲基化反应系统。[方法]PCR扩增小鼠全长Setd3,插入到pEGX-4T-1载体获得pEGX-4T-1-Setd3质粒。将质粒转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-SETD3蛋白并进行纯化。将获得的GST-SETD3蛋白定量后进行体外组蛋白甲基化反应,用Western Blot检测GST-SETD3对组蛋白H3K4及H3K36的甲基化情况。[结果]p GEX-4T-1-Setd3质粒构建正确,纯化的GST-SETD3蛋白纯度较高;甲基化反应结果表明,用不同来源的组蛋白、反应时间、反应缓冲液及检测方法均检测不到GST-SETD3二甲基化H3K4;GSTSETD3可以二甲基化H3K36。[结论]成功表达和纯化GST-SETD3蛋白;该蛋白可以使H3K36发生二甲基化,但不能使H3K4二甲基化。成功构建体外甲基化反应系统。; 钟玙沄黄梦怡孙江黄穗李月罗海华姜勇刘靖华; 关键词：蛋白纯化甲基化反应甲基转移酶

人BNIP3基因在Hela细胞中的表达及定位被引量：1: 2009年; 目的:构建BNIP3-HA融合蛋白的真核表达载体,观察BNIP3在Hela细胞中表达及其定位。方法:采用两步克隆法将HA和BNIP3的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染Hela细胞。BNIP3经AlexaFluor 488免疫荧光标记,线粒体用MitoFluor Red 589染色后在荧光显微镜下观察BNIP3的表达和定位。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定构建正确,并在Hela细胞中能够表达,在荧光显微镜下观察,BNIP3-HA融合蛋白分布于线粒体。结论:成功构建BNIP3-HA融合蛋白表达载体并在Hela细胞线粒体中表达。; 陈登宇刘芸钟田雨王蔚赵明哲刘靖华姜勇; 关键词：基因 BCL-2 HELA细胞线粒体荧光免疫测定细胞内定位

白蛋白融合蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达和定位被引量：1: 2009年; 目的:构建白蛋白-血凝素(Alb-HA)融合蛋白的真核表达载体,观察Alb在NIH3T3细胞中表达和定位。方法:采用两步克隆法将HA和Alb的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染NIH3T3细胞在荧光显微镜下观察Alb的表达和分布。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在NIH3T3细胞中大量表达,免疫荧光标记后在荧光显微镜下观察,Alb-HA融合蛋白分布于细胞质内。结论:成功构建Alb-HA融合蛋白表达载体并表达于NIH3T3细胞中,为下一步深入研究Alb的细胞内功能奠定了基础。; 刘承武陈登宇胡水旺刘靖华姜勇; 关键词：白蛋白 NIH3T3细胞细胞内定位

C反应蛋白真核表达载体的构建与表达被引量：3: 2008年; 目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。; 陈腾祥李红梅胡水旺刘靖华姜勇; 关键词：C反应蛋白基因表达蛋白定位

Rab蛋白在吞噬体成熟中的作用被引量：2: 2017年; 吞噬体成熟是指吞噬细胞吞噬病原体形成的吞噬体与溶酶体融合的过程.吞噬体与溶酶体融合后形成吞噬溶酶体,病原菌被溶酶体内的各种水解酶如氧化酶、酸化酶、水解酶等降解杀灭,因此吞噬体成熟是吞噬细胞消灭病原体的关键环节.大量研究发现,Rab GTPases通过介导吞噬体与溶酶体融合及促进吞噬溶酶体酸化在吞噬体的成熟过程中发挥了非常重要的作用.Rab分子异常会影响吞噬体成熟并进而影响细菌的杀灭,导致感染相关疾病的发生.; 赵舒祺刘靖华; 关键词：RAB GTPASES 细菌清除

NF-κB信号通路对BLP耐受巨噬细胞iNOS表达的影响被引量：3: 2014年; 目的通过检测细菌脂蛋白(BLP)耐受巨噬细胞感染细菌时诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达情况及其表达是否受NF-κB信号通路调控,探讨BLP耐受巨噬细胞对细菌清除能力增强的机制。方法比较BLP耐受和非耐受(Naive)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMM)对大肠杆菌的吞噬及杀灭情况,评价BLP耐受巨噬细胞的细菌清除能力;用定量PCR技术检测BLP耐受的BMM内iNOS mRNA表达情况和细胞免疫荧光技术观察p65从胞质向胞核的移位情况;最后观察抑制NF-κB通路活化对iNOS mRNA表达的影响。结果 BLP耐受巨噬细胞吞噬细菌和杀灭细菌的能力较Naive细胞显著增强(P<0.05);iNOS mRNA表达水平较Naive细胞显著(P<0.05);如果抑制BLP耐受巨噬细胞NF-κB通路活化对iNOS mRNA表达有显著影响(P<0.05)。结论本研究结果提示细菌脂蛋白耐受通过NF-κB通路活化增强细菌感染巨噬细胞iNOS表达。; 李雪王义乾罗海华钟玙沄雷烨铭雷山蔡军伟姜勇刘靖华; 关键词：INOS

两种细胞系中内源性C-反应蛋白的表达和定位分析: 2008年; 目的观察在不同刺激条件下,不同组织来源细胞系中内源性C-反应蛋白(CRP)的表达及定位情况。方法培养人单核细胞系THP-1和人肝细胞系LO2,用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞;使用内毒素(LPS)对两种细胞进行刺激,同时收集LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清加入到LO2细胞的培养液中进行孵育,运用Western blot和免疫细胞化学技术检测上述刺激条件下CRP在两种细胞中的表达及其定位情况。结果Western blot检测表明,在未受到刺激时,两种细胞的裂解物中均检测到一定量的CRP,在细胞培养液上清中没有检测到;受到LPS刺激后,THP-1细胞内的CRP表达增加,且在培养液上清中也检测到少量的CRP,但对于LO2细胞,刺激前后CRP的表达和分泌没有明显变化;当用LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清处理LO2细胞后,在LO2的细胞裂解物和培养液上清中均检测到CRP。免疫细胞化学检测结果显示,整个THP-1细胞中均可检测到标记的CRP的荧光信号,其中以核内的最明显,LPS刺激可以增加该蛋白的表达,使其核定位更加明显;在LO2细胞中,CRP定位于核外,LPS刺激对其表达和定位没有明显影响,而给予LPS刺激的THP-1细胞培养液上清处理后,LO2细胞中标记CRP的荧光信号增强,尤其以细胞膜上的增强明显。结论LPS不能直接上调肝细胞LO2内的CRP表达,却可以诱导THP-1表达分泌某些细胞因子来增加CRP的合成分泌;CRP在肝细胞系LO2和单核-巨噬细胞系THP-1中的定位有明显不同,在LO2中主要表现为分泌型蛋白的定位特征,而在THP-1细胞中却有明显的核定位表现。; 陈腾祥李红梅胡水旺杨婷刘亚伟刘靖华姜勇; 关键词：C-反应蛋白蛋白定位单核细胞佛波酯

细胞酶联免疫吸附试验在检测噬菌体阳性克隆中的应用和改进被引量：4: 2008年; 目的:通过对影响细胞ELISA的关键条件和步骤进行优化和改进,以降低实验假阳性率,提高敏感性。方法:THP-1细胞接种96孔培养板,分别用脂多糖(LPS)刺激或不刺激作为处理组和对照组,将通过噬菌体展示技术筛选获得的噬菌体分别与处理组及对照组细胞作用,洗脱未结合的噬菌体,加入HRP标记的抗M13单克隆抗体,分别用酶标仪和Kodak IS 2000R数码成像系统检测细胞与短肽的结合情况。并针对细胞的特性,在细胞的准备、固定、孵育和洗涤等关键步骤进行改进。结果:酶标仪和数码成像系统检测分别得到6个和8个可与细胞高亲和力结合的阳性噬菌体克隆,经过免疫荧光实验证实数码成像系统检测得到的8个阳性克隆均与细胞结合,并且数码成像系统多次测量值具有很好的重复性。结论:本方法为蛋白质与完整细胞的亲和活性研究提供了有效的实验方案,具有较好的应用前景。; 丁宁刘承武李志杰刘靖华邓鹏姜勇; 关键词：细胞酶联免疫吸附测定噬菌体展示

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达被引量：1: 2005年; 目的构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体,并分析其在HEK293细胞中的表达。方法从重组pcDNA3/HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上,经PCR、酶切和测序鉴定,将重组质粒pcDNA3-flag/HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞,细胞裂解后,用Westernblot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag/HPC2构建正确,并可在HEK293细胞内高效表达。结论成功构建了pcDNA3-flag/HPC2真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达,为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。; 谭康联李志杰刘靖华黄浩唐靖邓鹏姜勇; 关键词：基因表达转染

一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选被引量：2: 2006年; 以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetratingpeptide,CPP).采用点突变技术,首先在pET-14b载体多克隆位点NdeⅠ和XhoⅠ之间加入4个限制性内切酶位点,随后在BamHⅠ位点后加入三联终止密码子,接着再利用亚克隆的方法在KpnⅠ和XhoⅠ之间插入EGFP,形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamHⅠ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法,利用这种方法对文库进行筛选.酶切和测序表明,示踪载体的构建是正确的,且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了105个独立克隆,其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的,并用此方法进行了初步的筛选.; 刘瑜刘亚伟李海玉刘靖华邓鹏姜勇; 关键词：跨膜转运内化

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