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体外诱导成人成肌细胞转化为神经前体细胞被引量：4: 2006年; 目的探讨成人成肌细胞在体外能否转化为神经前体细胞。方法从成人正常颞肌分离单细胞,体外培养及克隆纯化,培养至第三代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液诱导分化,观察诱导后细胞的形态变化,并进行免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析。结果成肌细胞经诱导后聚集成球,悬浮生长。免疫细胞化学染色见细胞球表达巢蛋白,5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验阳性;细胞分化后表达神经丝蛋白68,胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂。RT-PCR分析结果与免疫细胞化学染色结果一致。结论成人成肌细胞在体外一定条件下诱导能够转化为神经前体细胞。; 张振兴李桂林窦万臣魏宇魁吴海涛孔燕国范明王任直; 关键词：干细胞成肌细胞神经前体细胞

重组腺相关病毒载体在大鼠海马内转导特征及其细胞亲嗜性被引量：5: 2006年; 目的探讨3种不同血清型重组腺相关病毒（rAAV1、rAAV2和rAAV5）载体在大鼠海马内转导效率及细胞亲嗜性的差异，从而选择更加适于中枢神经系统（CNS）转基因治疗的载体。方法雄性健康成年SD大鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别接受立体定向注射剂量和滴度相匹配的rAAV1、rAAV2、rAAV5载体，以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因，于注射后8周取脑行序列冰冻切片，以荧光显微镜观察EGFP在脑内的表达情况，并以Image-Pro Plus图像处理系统自动测量表达的面积和阳性细胞数量；为确定rAAV载体在CNS中的细胞亲嗜性，以神经元核性蛋白（NeuN）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光双重标记法观察EGFP在不同类型神经细胞的表达情况。结果各组EGFP表达呈现不同分布特征，rAAV1介导EGFP在海马CA1～CA3区绝大多数锥体细胞及齿状回的颗粒细胞中表达，rAAV2主要局限于齿状回门区的多形细胞层，rAAV5仅在CA1和CA2区锥体细胞层的少量细胞中表达。最大嘴尾侧转导距离、最大转导面积和EGFP阳性细胞计数rAAV1均显著大于rAAV2和rAAV5（P〈0．01），rAAV2和rAAV5比较，差异均无显著性（P〉0．05）。免疫荧光标记显示rAAV1既可以转导神经元，又可以转导胶质细胞；而rAAV2和rAAV5则仅可转导神经元。结论 rAAV1不仅可以比rAAV2和rAAV5转导更大的范围和细胞数量，而且具有更广的组织亲嗜性，是一种高效的转基因载体。; 栗世方李照建李桂林窦万臣张振兴魏俊吉孔燕国徐珑高俊王任直; 关键词：重组腺相关病毒血清型海马基因转导

N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基口服基因疫苗的制备和激活SD大鼠产生循环抗体的初步报告被引量：4: 2004年; 目的　研制携带 N-甲基 -D-天冬氨酸受体 1 ( N-methyl,D-aspartate receptor subunit1 ,NR1 )的口服疫苗 ,探讨疫苗激活 SD大鼠产生循环抗体的可能性。方法　采用聚合酶链反应、酶切连接和蓝白筛选的方法构建NR1的表达载体 ;以磷酸钙共沉淀的方法转染 HEK2 93细胞 ,并用 G41 8筛选阳性细胞克隆 ;应用逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色方法鉴定阳性细胞株 ;经氯化钙法制备携带 NR1表达载体的减毒鼠伤寒沙门 (氏 )菌口服疫苗 ( SL-NR1 ) ;胃内灌注 60 0 μL、D( λ) 2 6 0 nm为 0 .6的 S L-NR1 ,2周内 4次给药 ;以阳性细胞株为靶细胞 ,用免疫荧光方法检测大鼠循环中 NR1抗体滴度。结果　扩增出 NR1基因并构建了含有 NR1基因的表达载体—— p CDNA3 .1 -NR1 ;建立了细胞株 HEK 2 93 -NR1 ;证实口服疫苗可激活 SD大鼠 ( 2 3 /2 5只 )产生 NR1抗体。结论　成功研制了携带 NR1基因的口服减毒鼠伤寒沙门 (氏 )菌活疫苗 ,其可激活机体免疫反应产生 NR1抗体。; 田士强王任直李桂林张波姚勇窦万臣孔燕国张振兴栗世方; 关键词：口服疫苗循环抗体

人成肌细胞向神经前体细胞转分化及在大鼠体内移植的研究: 2006年; 目的探讨成人成肌细胞能否转分化为神经前体细胞。方法从6例成人正常颞肌标本中分离培养成肌细胞,培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液,诱导2周,对诱导细胞进行免疫细胞化学鉴定和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析;将诱导细胞和人成肌细胞分别移植到12只脑缺血大鼠脑内,采用免疫组织化学植细胞的存活和分化进行鉴定。结果成肌细胞在经诱导7 d 后开始聚集成球,悬浮生长,该细胞球平均每14 d 传代1次。细胞球均表达巢蛋白,在分化条件下,(36±6)%的细胞表达微管相关蛋白2,(44±5)%的细胞表达胶质纤维酸性蛋白,(17±4)%的细胞表达半乳糖脑苷脂;经诱导细胞移植到大鼠脑内后表达微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白。而对照组的成肌细胞则不表达上述标志物。结论人成肌细胞在体外一定诱导条件下能够转分化为神经前体细胞。; 张振兴王任直李桂林窦方臣栗世方魏俊吉魏宇魁赵飞帆孔燕国吴海涛范明; 关键词：干细胞神经再生成肌细胞

体外培养诱导成人骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的实验被引量：6: 2006年; 目的:以含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液对原代培养的成人骨骼肌干细胞进行诱导,探讨其转化为神经细胞的可行性。方法:实验于2004-06/12在军事医学科学院基础医学研究所完成。实验所用3例成人正常颞肌标本取自于开颅手术患者,由北京协和医院神经外科提供,患者知情同意。机械分离加混合消化液处理分离单细胞,体外培养及克隆纯化,培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子二甲基亚砜的培养液诱导分化,进行反转录-聚合酶链反应分析和免疫荧光细胞化学染色,观察诱导后细胞形态变化,同时结合普通光线在100倍下随机计数6个视野(大于100个细胞),计算阳性细胞的百分比。结果:①骨骼肌干细胞培养24h后见少量细胞贴壁呈短的梭形或棒状。培养第3天红细胞开始裂解成细胞碎屑并聚集、悬浮在培养基中,这些碎屑随着换液而逐渐消失。克隆培养的细胞大约于接种后两三周才能铺满孔底,胞体呈梭形,排列规整。②荧光显微镜下胞核蓝染,每个细胞都呈Desmin染色阳性,证明成人骨骼肌干细胞能够在体外进行克隆培养。③在含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液诱导下,骨骼肌干细胞可分化为形态上类似于神经元和星形胶质细胞的细胞。④反转录-聚合酶链反应分析证实诱导后的骨骼肌干细胞有神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白基因表达。⑤免疫荧光细胞化学检测到诱导后的骨骼肌干细胞呈神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫反应阳性。⑥诱导后骨骼肌干细胞分化为神经丝蛋白阳性细胞的比例为(35.9±6.3)%,分化为胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例为(43.7±5.3)%。结论:成人骨骼肌干细胞在体外经诱导分化后形态类似于神经元和星形胶质细胞,并且表达神经元标志物神经丝蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,�; 张振兴汪璇刘淑红吴海涛窦万臣栗世方孔燕国魏宇魁赵飞帆范明王任直; 关键词：干细胞二甲亚砜神经元

骨髓间充质干细胞治疗大鼠缺血性脑卒中的实验研究被引量：14: 2007年; 目的研究骨髓间充质干细胞(BMSC)对大鼠缺血性脑卒中的治疗作用及治疗机制。方法采集人志愿者骨髓,密度梯度离心法分离、培养 BMSC;建立大脑中动脉栓塞缺血2 h 再灌注大鼠模型,根据神经损伤评分将符合标准的60只脑缺血模型大鼠随机分为治疗组(BMSC 移植组,48只)和对照组(D-Hanks 液注射组,12只),24 h 后在脑缺血边缘区皮层分别注射 hBMSC 悬液和 D-Hanks 液;移植后第4天开始进行粘贴物移除实验、转棒实验及 Morris 水迷宫实验的循环测试至第32天;治疗组分别在移植后1、2、3及4周分批次处死大鼠,通过免疫荧光技术动态追踪 BMSC 并检测细胞的迁移和分化。结果移植后第1、2周细胞大量存活并向病灶迁移,第3周细胞存活数量明显减少,第4周存活细胞极少;hBMSC 在大鼠脑内没有明确表达微管相关蛋白(MAP)2、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC)等神经细胞的特异蛋白。治疗后1周水迷宫平均逃逸时间,治疗组为(69±10)s,对照组为(120±0)s,P<0.05,至第4周两组差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后第10天转棒实验(10 r/min)平均潜伏期,治疗组为(167±18)s,对照组为(37±19)s,P<0.05,至实验终期差异仍有统计学意义。治疗后第13天粘贴物移除实验平均潜伏期,治疗组为(33±8)s,对照组为(84±13)s,P<0.05,至实验终期差异仍有统计学意义。结论 BMSC 脑内移植可以显著改善脑缺血大鼠神经功能的恢复;移植细胞在大鼠脑内可以向病灶周围迁移,但是细胞存活有一定时限性;BMSC 在大鼠脑内没有明确分化为经细胞。; 魏俊吉曾立芬樊晓彤王裕马文斌李桂林窦万臣张振兴栗世方冯铭韩钦李照建张子衡康军孔燕国王任直赵春华; 关键词：骨髓干细胞移植脑卒中大脑中动脉梗塞细胞分化

脑胶质瘤特异性6HRE-GFAP-Bax α基因治疗系统的构建被引量：1: 2006年; 　　脑胶质细胞瘤基因治疗的关键是治疗的安全性和有效性,因此需要构建对胶质瘤特异而高效表达的基因表达系统.目前研究中多采用端粒酶逆转录酶催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）启动子介导凋亡基因表达,然而该启动子表达效率低下,限制了进一步的应用.本实验依据恶性胶质瘤体内部低氧的微环境,构建对低氧敏感的6HRE-GFAP杂合启动子（hypoxia responsive element,低氧反应元件）和（glial fibrillary acidic protein,胶质纤维酸性蛋白）,使之介导治疗基因在胶质瘤细胞内表达,产生治疗作用,而正常脑组织细胞虽有基因转染,但不表达毒性产物,从而构建出针对胶质瘤细胞特异而高效的表达载体.; 田永吉李桂林高俊王任直孔燕国张振兴栗士方田士强窦万臣张波; 关键词：基因治疗系统脑胶质瘤低氧反应元件基因表达系统脑胶质细胞瘤

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张振兴

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