沈鹏鹏
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
- 供职机构：扬州大学兽医学院更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达被引量：4
- 2009年
- 【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA(short interference RNA,siRNA)的禽U6启动子。【方法】以鸡基因组为模板进行PCR扩增,将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析,并将其插入报告基因载体pEGFP-N1中,获得siRNA表达载体pGFP-U6,将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA(short hairpin RNA)插入其中,获得pGFP-U6-shRNA;以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照,分别转染COS-1和DF-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆的U6启动子位于鸡28号染色体,与发表的鸡U6-3启动子同源性为97.2%,含多个Oct-1序列,不含CACCC框、SPH和PSE等聚合酶Ⅲ启动子序列,TA框不典型;在pGFP-U6-shRNA转染的哺乳动物源COS-1细胞培养中,GFP阳性细胞数和荧光总量均有所下降,但不如pGFP-H1-shRNA转染细胞显著;在pGFP-U6-shRNA转染的禽源DF-1细胞培养中,不仅GFP阳性细胞数和荧光总量显著下降,而且基因沉默效果显著优于pGFP-H1-shRNA转染细胞。【结论】成功克隆的禽U6启动子不仅能有效转录siRNA,而且转录活性具有相对的细胞种属特异性。
- 王永娟沈鹏鹏张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：克隆转录活性
- 重组禽腺联病毒介导的miRNA抑制传染性法氏囊病病毒在鸡胚内的复制
- 2011年
- 【目的】在鸡胚水平上探索VP1和VP2基因特异miRNA抑制传染性法氏囊病病毒(infectious bursaldisease virus,IBDV)复制的可行性。【方法与结果】将表达VP1基因特异miRNA重组载体pAITR-RFPmiVP1或VP2基因特异miRNA重组载体pAITR-RFPmiVP2E与禽腺联病毒(avian adeno-associated virus,AAAV)包装载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper共转染AAV-293细胞,获得重组病毒rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E,用同样方法获得不表达miRNA的rAAAV-RFP和表达对照miRNA的rAAAV-RFPmiVP2con。电镜观察显示重组病毒具有典型的AAAV颗粒形态;PCR检测结果表明其基因组中含miRNA表达盒;经poly(A)加尾RT-PCR检测证明重组病毒感染细胞能表达基因特异的miRNA。分别将重组病毒经卵黄囊途径接种8日龄SPF鸡胚,然后经绒毛尿囊膜途径用Lukert株IBDV攻毒,收获鸡胚进行IBDV组织细胞半数感染剂量(TCID50)测定。结果在攻毒后第3天,rAAAV-RFP和rAAAV-RFPmiVP2con接种组的IBDV TCID50为8.0 log10,rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E接种组的IBDV TCID50分别下降到1.0和1.5 log10;在攻毒后第6天,rAAAV-RFP和rAAAV-RFPmiVP2con接种组的IBDV TCID50仍为8.0 log10,rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E接种组的TCID50分别下降到0.8和2.0 log10。【结论】rAAAV是有效的miRNA鸡胚导入载体,表达的VP1和VP2基因特异miRNA能有效阻断IBDV复制。
- 沈鹏鹏王永娟孙怀昌张鑫宇夏晓莉
- 关键词：MIRNA
- 重组质粒表达的IBDV vp2基因特异miRNA对IBDV复制的抑制作用
- 用Genscript软件分析IBDV结构蛋白vp2基因序列，预测得5个潜在的miRNA，将其插入表达载体pRFPRNAiC。将重组载体与报告载体pVP2-GFP共转染DF-1细胞，经Northern dot blotti...
- 王永娟孙怀昌沈鹏鹏张鑫宇夏晓莉夏冰
- 关键词：RNA干扰VP2基因病毒复制RNAI抑制
- 重组质粒表达的IBDV vp2基因特异miRNA对IBDV复制的抑制作用
- 用Genscript软件分析IBDV结构蛋白vp2基因序列,预测得5个潜在的miRNA,将其插入表达载体pRFPRNAiC。将重组载体与报告载体pVP2-GFP共转染DF-1细胞,经Northern dot blotti...
- 王永娟孙怀昌沈鹏鹏张鑫宇夏晓莉夏冰
- 关键词：IBDVVP2RNA干扰
- 文献传递
