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BTI基因转染诱导EC9706细胞凋亡及G_1阻滞被引量：2: 2010年; 为了研究荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsin inhibitor,BTI)对肿瘤细胞凋亡与细胞周期的影响,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与BTI融合蛋白真核表达质粒.将BTI基因成功克隆至pEGFP-N1中转染食管癌EC9706细胞后,激光共聚焦显微镜镜检显示,BTI-EGFP获得良好表达.表达的融合蛋白大部分分布于细胞核,在细胞质中有少量分布.Western印迹检测可见约27kD和36 kD的特异性条带.流式细胞术分析结果显示,BTI能够诱导EC9706细胞发生凋亡,并使细胞停滞于G0/G1期.; 李玉英田欣张政王转花; 关键词：绿色荧光蛋白食管癌EC9706细胞细胞周期

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响被引量：10: 2009年; 先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2后,采用MTT比色法检测抑制剂对HepG2细胞的抑制率,用DNA凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测HepG2细胞的凋亡.结果表明,rBTI在体外能够明显抑制HepG2细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA水平有关.通过RT-PCR检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下调,促凋亡基因Bax mRNA有所上调,而对照GAPDH无变化.对HepG2细胞中Fas/Fas配体及半胱氨酸天冬酶(caspase)的研究证明,细胞经过rBTI处理后,对死亡受体Fas mRNA没有影响;rBTI可明显激活caspase-3和caspase-9酶活性,对caspase-8活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI对HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及Fas/Fas配体途径.; 李芳李玉英白崇智田欣张政王转花; 关键词：细胞凋亡人肝癌细胞

rBTI活性位点分析及其突变体的研究: 蛋白酶抑制剂(PI，protease inhibitor)在动物、植物、微生物以及人类自身的代谢调控过程中起着非常重要的作用。抑制剂与蛋白酶的协同调节使体内各种生理过程得以有条不紊的进行。由于抑制剂功能的重要性与独特性，...; 田欣; 关键词：定点突变活性位点抗肿瘤药物理化性质; 文献传递

重组荞麦蛋白酶抑制剂aBTI的表达及其对肝癌HepG2细胞增殖的影响被引量：1: 2010年; 为了深入研究不同类型荞麦蛋白酶抑制剂在抑制肿瘤细胞生长及诱导其发生凋亡方面的作用,本实验在先前得到的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的基础上,运用定点突变技术将rBTI的活性位点进行替换,构建一种新型蛋白酶抑制剂aBTI。通过在大肠杆菌M15[pREP4]中表达,获得以可溶形式存在的aBTI目的蛋白。经Ni^(2+)-NTA亲和层析及superdex 75分子筛层析纯化,目的蛋白的纯度达到95%以上。抑制活性测定表明,aBTI具有专一性的弹性蛋白酶抑制活性,抑制常数K_i为3.34×10^(-7)mol/L。MTT比色法检测及细胞核形态学观察显示,aBTI在体外能够显著抑制HepG2肿瘤细胞的增殖(IC_(50):1.88μmol/L),并诱导其凋亡,具有较好的抗肿瘤效应。; 田欣李玉英王转花; 关键词：荞麦蛋白酶抑制剂定点突变抗肿瘤

野生型和突变型荞麦蛋白酶抑制剂的活性比较及抗肿瘤功能分析被引量：9: 2010年; 运用定点突变技术研究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的作用位点,先后构建了R45A-aBTI和R45F-fBTI两个突变体.抑制活性测定显示,aBTI和fBTI均丧失了胰蛋白酶抑制活性,却分别增加了对弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性,确定Arg45为野生型rBTI的作用位点.稳定性分析表明,rBTI、aBTI和fBTI均具有很高的热稳定性及酸碱稳定性.采用MTT比色法分别检测野生型和突变型抑制剂对肿瘤细胞生长的抑制作用.结果表明,突变前后的3种抑制剂对HL-60和EC9706细胞的生长均显示出很强的抑制作用,并且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性.通过研究不仅确定了rBTI的作用位点,而且获得了两种新型蛋白酶抑制剂,且作用位点的改变并不影响其对肿瘤细胞的生长抑制作用.为进一步研究胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系以及抗肿瘤药物的研制提供了新的思路.; 田欣李晨李玉英王转花; 关键词：荞麦蛋白酶抑制剂作用位点

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田欣