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沉默HIF-2α表达对低氧下乳腺癌干细胞微球体富集的影响被引量：4: 2013年; 目的:探讨沉默低氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)表达对低氧下乳腺癌干细胞(breast cancerstem cells,BCSCs)微球体富集的影响。方法:构建HIF-2αRNA干扰慢病毒载体,并转染至MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot检测HIF-2αmRNA及蛋白表达;MTT检测MCF-7细胞在不同氧浓度下增殖活性;显微镜下观察低氧下BCSCs微球体形成情况;有限稀释法检测微球体细胞单克隆形成能力;RT-PCR检测微球体细胞干细胞相关标志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表达。结果:成功构建了HIF-2α基因siRNA慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot结果显示干扰组细胞HIF-2αmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与未转染组及空载体组比较,低氧下RNA干扰组细胞增殖活性及BCSCs单克隆形成能力明显降低(P<0.05);RT-PCR结果亦显示RNA干扰组BCSCs相关标志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表达显著降低(P<0.05)。结论:低氧能够诱导和强化MCF-7细胞乳腺癌癌干细胞样特性,而沉默HIF-2α表达可抑制低氧下BCSCs富集,提示HIF-2α有望成为乳腺癌治疗新的靶点。; 屈洪波范原铭韩明利陈鑫吴诚义汤为学; 关键词：MCF-7

sIL-2R在乳腺癌化疗前后的表达及临床意义: 目的:研究乳腺癌患者化疗前后外周血中sIL-2R水平的变化,探索sIL-2R在乳腺癌诊断治疗方面的临床应用价值。方法:采用ELISA法分别测定乳腺癌患者化疗前后外周血sIL-2R水平,并以健康人群为对...; 范原铭; 关键词：可溶性白细胞介素2受体; 文献传递

沉默叉头框C2基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞的化疗增敏作用被引量：2: 2013年; 目的观察沉默叉头框C2 （FOXC2）基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞多西紫杉醇化疗敏感性的影响.方法通过脂质体介导将FOXC2短发卡RNA干扰表达质粒FOXC2-小干扰RNA（siRNA）转染至MDA-MB-231细胞,并检测转染48 h后的FOXC2 mRNA及蛋白表达；荧光显微镜观察72 h后的细胞凋亡形态学；流式细胞术检测72 h后的细胞凋亡率及细胞周期.结果与未转染组细胞及空载体组细胞比较,干扰组细胞出现典型凋亡形态学改变,且FOXC2 mRNA及蛋白表达明显降低（P＜0.05）；噻唑蓝（MTT）显示干扰组细胞对多西紫杉醇敏感性增加,半数抑制浓度（IC50）由（6.08±1.23） mg/L降至（0.65 ±0.01） mg/L；同时,干扰组细胞早期凋亡率为（20.01±0.19）％,明显高于其他3组（P＜0.05）,且S期及G0/G1期细胞比例减少,G2/M期细胞比例增多（P＜0.05）.结论以siRNA下调FOXC2表达可有效诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡,并增强其对多西紫杉醇的化疗敏感性.; 屈洪波吴诚义范原铭曾妮汤为学; 关键词：乳腺癌多西紫杉醇脱噬作用增敏作用

沉默FOXC2对TGF-β_1诱导的MCF-7细胞上皮-间质转化的逆转作用被引量：10: 2013年; 目的:探讨沉默叉头框C2(FOXC2)表达对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人乳腺癌MCF-7细胞上皮-间质转化(EMT)的逆转作用和对乳腺癌侵袭性的影响。方法:将体外培养的MCF-7细胞用5μg/L TGF-β1处理,相差显微镜观察细胞形态学变化;免疫荧光检测EMT相关标志物表达。慢病毒介导的FOXC2-siRNA载体转染至TGF-β1诱导成功的MCF-7细胞,以RT-PCR和Western blotting方法检测FOXC2及EMT相关标志物上皮性钙黏蛋白(E-cad)、紧密连接蛋白1(CLDN1)、纤维连接蛋白1(FN1)mRNA及蛋白表达;Transwell小室模型检测沉默FOXC2表达对TGF-β1诱导的MCF-7细胞侵袭性的影响。结果:TGF-β1可诱导MCF-7细胞向间质样细胞表型转换,并上调间质样标志物FN1表达和下调上皮样标志物E-cad及CLDN1表达;而沉默FOXC2表达可逆转已间质化的MCF-7细胞恢复至上皮表型,并降低其侵袭性。结论:TGF-β1可诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生EMT并增加其侵袭性,且TGF-β1这种诱导作用能被FOXC2-siRNA所逆转,并降低细胞的侵袭能力。; 屈洪波吴诚义范原铭韩明利陈鑫汤为学; 关键词：上皮-间质转化 FOXC2 MCF-7细胞转化生长因子Β

缺氧对人乳腺癌细胞微球体生长及化疗耐药性的影响: 2013年; 目的研究缺氧对人乳腺癌细胞微球体(mammospheres,MSs)培养效率及其化疗耐药性的影响。方法分别在常氧及缺氧条件下对人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行无血清悬浮培养,观察记录MSs的生长速率及体积变化。MTT比色法检测各组人乳腺癌微球体细胞(mammospheres-derived cells,MSDCs)及MDA-MB-231细胞在不同浓度、不同药物作用下的存活率(survive rate,SR)。免疫组织荧光化学法检测HIF-2α、ABCG2在各组MSDCs中的表达。Western blot检测乳腺癌干细胞标志物CD44及ALDH1在各组MSDCs中的表达。Western blot及Real-time RT-PCR检测HIF-2α、ABCG2、P-gp及MDR1在各组MSDCs中的表达。结果缺氧组MSs生长速率及球体体积优于常氧组。缺氧组MSDCs在不同化疗药物作用下的SR高于常氧组MSDCs及MDA-MB-231细胞(P<0.05)。免疫组织荧光化学检测发现HIF-2α及ABCG2在缺氧组MSDCs中的表达强于常氧组。Western blot检测发现CD44与ALDH1在缺氧组MSDCs中表达量高于常氧组。缺氧组MSDCs中HIF-2α、ABCG2及P-gP蛋白表达量均高于在常氧组MSDCs及MDA-MB-231细胞中的表达(P<0.05)。Real-time RT-PCR检测发现缺氧组MSDCs中HIF-2α、ABCG2及MDR1 mRNA的表达量均高于常氧组MSDCs及MDA-MB-231细胞(P<0.05)。结论以HIF-2α为启动因子,ABCG2、MDR1及P-gP等为效应因子的生物化学反应可能是缺氧状态加快MSs的成球速度、提高其球体体积、增强其化疗耐药能力的可能机制。; 范原铭屈洪波吴诚义侯婧韩明利; 关键词：化疗耐药

沉默HIF-2α对低氧下接种乳腺球细胞的裸鼠移植瘤生长的影响被引量：2: 2013年; 目的探讨RNA干扰（RNAi）沉默HIF-2α表达对低氧下接种乳腺球细胞的裸鼠移植瘤生长的影响。方法将慢病毒介导HIF-2α基因RNAi载体质粒和空载体质粒转染至MCF-7细胞株，G418筛选获得稳定转染细胞株。将空载体组及干扰组MCF-7细胞注射接种至裸鼠左右侧背部近后肢皮下，比较成瘤时间，肿瘤体积及瘤体重量等；Western印迹检测移植瘤组织中HIF-2α、CIM4、OCT-4及KLF4蛋白表达。结果成功构建HIF-2α基因RNAi慢病毒载体，沉默HIF-2α表达降低乳腺球的形成；与空载体组比较，干扰组移植瘤生长速率、肿瘤体积和重量均明显降低（P〈0．05）。Western印迹显示干扰组HIF-2α蛋白表达量（0．42±0．01）明显低于空载体组（0．89±0．03，P〈0．05），CD44蛋白表达量（0．21±0．01）明显低于空载体组（0．78±0．03，P〈0．05），OCT-4蛋白表达量（0．134-0．01）明显低于空载体组（0．68±0．03，P〈0．05），KLF4蛋白表达量（0．34±0．01）明显低于空载体组（0．72±0．03，P〈0．05）。结论RNAi沉默HIF-2α表达明显抑制低氧下乳腺球细胞裸鼠移植瘤生长，其机制可能通过下调干细胞标志物表达抑制乳腺癌细胞自我更新和增殖，HIF-2α有望成为乳腺癌基因治疗新的靶点。; 屈洪波范原铭韩明利曾妮朱之坤刘红谢佳吴诚义汤为学; 关键词：RNA干扰移植物

SIL-2R在乳腺癌化疗前后的表达及临床意义: 2007年; 目的：研究乳腺癌患者化疗前后外周血中SIL-2R水平的变化，探索SIL-2R在乳腺癌诊断治疗方面的临床应用价值。方法：采用ELISA法分别测定乳腺癌患者化疗前后外周血SIL-2R水平，并以健康人群为对照。结果：乳腺癌患者外周血中SIL-2R水平较健康对照组明显增高；Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌外周血SIL-2R水平低于Ⅲ-Ⅳ期患者；乳腺癌患者化疗后外周血中SIL-2R水平较化疗前降低；化疗无效组SIL-2R水平较化疗有效组高（P〈0．05）；乳腺癌ER和（或）PR阳性组与ER、PR阴性组之间SIL-2R水平无差异仍〉0．05）。结论：1、乳腺癌患者血清SIL-2R有较高水平的表达，且分期越晚表达水平越高。2．乳腺癌患者血清SIL-2R水平在化疗前后有显著性差异。; 范原铭孙治君; 关键词：白细胞介素2受体

阻断PI3K/Akt信号通路对低氧微环境中BCSCs微球体细胞增殖的影响被引量：5: 2013年; 目的:探讨LY294002特异性阻断磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路对低氧条件下乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)微球体细胞增殖的影响。方法:通过无血清悬浮培养技术从人乳腺癌MCF-7细胞中筛选BCSCs微球体,应用免疫荧光染色检测BCSCs相关标志物CD44及CD133的表达,MTT法检测不同浓度LY294002处理后BCSCs微球体细胞的增殖情况,RT-PCR法检测BCSCs微球体细胞中缺氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α)mRNA的表达,蛋白质印迹法检测BCSCs微球体细胞中HIF-2α、PI3K和磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白的表达。结果:筛选获得的微球体细胞高表达BCSCs相关标志物CD44和CD133。LY294002能有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的增殖,抑制效应在药物作用后72～96h最为明显(P<0.05)。与低氧组比较,低氧+LY294002组微球体细胞中HIF-2αmRNA及PI3K、p-Akt和HIF-2α蛋白表达水平均明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LY294002通过特异性阻断PI3K/Akt信号通路而有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的体外增殖能力。; 屈洪波韩明利范原铭曾妮朱之坤吴诚义汤为学; 关键词：乳腺肿瘤细胞低氧微球体乳腺癌干细胞

化疗后残存乳腺癌组织中乳腺癌耐药蛋白、P-糖蛋白的表达及其与癌干细胞的相关性被引量：27: 2013年; 目的通过对比化疗前乳腺癌组织和化疗后残存乳腺癌组织中乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)、P-糖蛋白(P-gp)表达差异,探讨其与乳腺癌干细胞(BCSCs)的相关性。方法免疫组织化学检测化疗前乳腺癌组织和化疗后残存乳腺癌组织ABCG2、P-gp及BCSCs标志物CD44及CD24蛋白的表达;免疫荧光检测"BCSCs微球体"细胞中CD44及CD24蛋白表达;有限稀释法检测"BCSCs微球体"细胞单克隆形成能力;Western blot检测"BCSCs微球体"细胞ABCG2、P-gp、CD44及CD24蛋白的表达。结果与化疗前乳腺癌组织相比,化疗后残存乳腺癌组织ABCG2、P-gp表达与CD44蛋白表达呈正相关(χ2=41.34,r=0.83;χ2=22.81,r=0.61);而其与CD24蛋白表达呈负相关(χ2=-21.25,r=0.72;χ2=-17.26,r=0.65);差异均有统计学意义(P<0.05)。化疗后残存乳腺癌组织中"BCSCs微球体"直径明显增加,且化疗后BCSCs含量是化疗前BCSCs含量的2.5倍;Western blot显示化疗后残存乳腺癌组织"BCSCs微球体"细胞ABCG2、P-gp及CD44蛋白表达明显升高(P<0.05),而CD24蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论化疗赋予残存乳腺癌组织"癌干细胞样"特征,导致乳腺癌多药耐药产生。; 屈洪波范原铭韩明利罗浩军谢佳刘红刘毫吴诚义汤为学; 关键词：乳腺癌干细胞耐药相关蛋白乳腺癌耐药蛋白 P-糖蛋白

Lenti-eGFP体外转染兔角膜上皮细胞的实验研究: 2011年; 目的:观察慢病毒载体(Lentivirus vectors,LVs)介导的增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,eGFP)基因转染离体兔角膜上皮细胞对其生理功能的影响。方法:角膜上皮细胞的原代及传代培养并细胞鉴定。分正常细胞组(对照组)与转染细胞组。LVs介导的eGFP基因(Lenti-eGFP)以最适感染复数(Multiples of infection,MOI)=100转染角膜上皮细胞并成功传代,倒置荧光显微镜观察eGFP的表达情况。HE染色光镜观察及透射电子显微镜观察2组细胞的形态及超微结构变化;计算2组细胞在传代第2、3、4天的细胞增殖率;流式细胞技术(Flow cytometer,FCM)检测2组角膜上皮细胞凋亡率的变化。结果:eGFP于转染48 h即开始有表达,随着转染时间的延长其在角膜上皮细胞内的表达增强。细胞成功传代后,eGFP仍明显表达于角膜上皮细胞。在最适感染复数,即MOI=100时,HE染色光镜观察见转染组细胞形态规则,无异常核分裂像,与对照组角膜上皮细胞形态一致;透射电子显微镜观察转染组细胞超微结构与对照组细胞无明显差别。2组细胞分别在传代第2、3、4天的增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。FCM检测细胞凋亡率2组间无明显差异(P>0.05)。结论:Lenti-eGFP可以有效转染离体兔角膜上皮细胞,但对上皮的影响需要进一步探讨。; 王继东马晓辉兰芬王健陈余范原铭杜之渝; 关键词：增强型绿色荧光蛋白角膜上皮细胞实验

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范原铭

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