张国民
- 作品数：13 被引量：17H指数：3
- 供职机构：中国人民解放军海军总医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划中国博士后科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人源性抗角蛋白单链抗体的构建及表达被引量：3
- 2005年
- 目的:克隆抗角蛋白抗体的可变区(V区)基因,构建抗角蛋白单链抗体(scFv)表达载体并表达。方法:根据人源性抗角蛋白Fab段的基因序列设计引物,用PCR方法克隆抗角蛋白抗体的V区基因,并重组到scFv的表达载体中,在大肠杆菌进行表达,表达产物经体外变性复性后进行SDS-PAGE鉴定。用ELISA检测其特异性结合活性。结果:成功地克隆抗角蛋白抗体的V区基因,构建了scFv的表达载体,并在大肠杆菌中表达。ELISA检测证实,表达的scFv保留了亲本Fab抗体的特异结合活性。结论:获得功能性抗角蛋白的scFv,可用于进一步的临床应用研究。
- 张国民陈宇萍王刚刘玉峰
- 关键词：角蛋白SCFV
- 抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达被引量：1
- 2005年
- 目的克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因并在原核细胞进行表达。方法用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和κ链的基因,重组到Fab表达载体中,在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab;根据前导肽序列设计引物,通过PCR介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列;以NIH3T3/erbB-2细胞ELISA法、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和κ链的基因,在大肠杆菌中表达出Fab段抗体但无特异性抗原结合活性,分别将Fd段和κ链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后,恢复了Fab段的抗原结合活性。单独恢复Fd段可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性。但同时恢复κ链后活性却有所下降。结论成功构建了抗p185小分子抗体Fab并进行功能性表达,为进一步构建抗p185鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础;进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性,为今后以PCR方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴。
- 张国民陈宇萍王琰乔媛媛安云庆
- 关键词：FAB可变区基因
- 抗地高辛人源小分子抗体的构建
- 2009年
- 目的:将从大容量噬菌体抗体库中筛选得到的人源抗地高辛单链抗体进行分泌表达,并构建Diabody(双体抗体)。方法:将抗地高辛的噬菌体抗体转染HB2151菌(无琥珀抑制基因的宿主菌),IPTG诱导,制备抗地高辛的可溶性单链抗体。选取活性较好的克隆进行基因改造,构建Diabody表达载体,并分泌表达,表达Diabody进行Western blot鉴定。结果:经ELISA结合活性测定,得到了结合活性较高的抗地高辛的可溶性单链抗体;基因改造后,经ELISA及Western blot测定证实获得了结合活性较好的抗地高辛Diabody。结论:实验获得了分泌表达活性可靠的人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源小分子抗体。
- 乔媛媛王琰赵晓航张国民陈宇萍
- 关键词：单链抗体DIABODY
- 抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达
- 目的:克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因,构建其表达载体并在原核细胞进行功能性表达.方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd...
- 张国民
- 关键词：P185抗体FAB段PCR
- 文献传递
- AAV2-BF转染小鼠对MLD内毒素攻击的抵抗作用
- 2006年
- 目的:通过观测BPI700-Fcγ1700嵌和基因导入小鼠,对最小致死量(MLD)内毒素攻击的抵抗作用,探讨抗感染基因治疗在临床感染高危人群中应用的可能性。方法:采用Dotblot、Westernblot、免疫组化、改良ELISA方法和内毒素/细胞因子检测试剂盒,检测目的基因产物在CHO细胞和小鼠骨骼肌细胞中的表达及血清中内毒素和促炎细胞因子含量变化。结果:(1)目的基因产物在CHO细胞和小鼠骨骼肌细胞中成功表达,在AAV2-BF导入组小鼠血清中可检测到目的基因产物;(2)在最小致死量内毒素攻击后,AAV2-BF导入组小鼠血清中内毒素和促炎细胞因子含量显著低于对照组小鼠;其存活率(40%)明显高于对照组小鼠(2·5%)。结论:AAV2-BF导入组小鼠对MLD内毒素攻击具有抵抗作用,提示抗感染基因治疗对临床G-菌败血症及其引发的内毒素中毒性休克具有较好防治作用。
- 关翔宇李晨李静吕喆彭智张国民李莉安云庆
- 关键词：内毒素促炎细胞因子
- 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv
- 2007年
- 目的从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体(scFv),测定其特异性结合活性并进行基因序列分析。方法以混合分子量人表皮角蛋白包被固相,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经4轮“吸附洗脱扩增”后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对阳性克隆抗体基因进行DNA指纹分析及序列同源性分析。结果经4轮筛选,获得9株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆,酶切鉴定正确后,经DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因。结论利用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体。
- 张国民乔媛媛陈宇萍吕喆安云庆
- 关键词：噬菌体抗体库角蛋白单链抗体
- BPI N端优势抗原表位的模拟合成及其人源抗体的筛选
- 2007年
- 杀菌／渗透增强蛋白（bactericidal／permeability increasing protein，BPI）是存在于人及哺乳动物多形核白细胞中的一种阳离子抗菌蛋白。研究证实BPI功能性氨基端片段（rBPl2。／rBPl23）具有与天然BPI55，相同的生物学活性，它们不仅能广谱杀伤G^-菌还能有效中和内毒素。
- 张国民陈宇萍乔媛媛王琰赵晓航安云庆
- 关键词：BPI人源抗体抗原表位PROTEINN端多形核白细胞
- 大容量人源噬菌体抗体库的构建及BPI N端抗体的筛选、表达和基因分析
- 背景：
(1)近年来，治疗性抗体的研究已成为生物工程药物研发的热点，国外已有近20余种抗体药物批准上市。由于人源性抗体对人体免疫原性低，更适于人体内应用，目前抗体药物的研制逐渐发展到以人源抗体为主。大容量抗体库...
- 张国民
- 关键词：生物信息学
- 文献传递
- 大容量人源噬菌体抗体库的构建被引量：9
- 2006年
- 目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体。方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lapPCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库。将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库。以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体。结果:经超感染重组,得到1·2×1010的大容量抗体库。经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody。结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库。
- 陈宇萍张国民乔媛媛王刚刘玉峰化冰王琰
- 关键词：噬菌体展示抗体库单链抗体
- 抗地高辛人源小分子抗体的获取
- 2006年
- 目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛抗体，并构建双体抗体。方法 以固相化的地高辛对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选，3～4轮后挑取克隆用酶联免疫吸附测定方法鉴定其特异性，对抗地高辛阳性抗体克隆进行DNA指纹分析及测序分析。选取活性好的克隆进行改造，构建双体抗体。结果 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象，获得了4株可与地高辛特异性结合的人源抗体，经DNA指纹分析及测序分析证明为不同克隆基因，阳性克隆的可变区基因轻链均属于入第一亚群，重链分别属于第三和第四亚群。选取4号克隆进行基因改造，构建双体抗体表达载体，获得了活性较好的双体抗体。结论利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗地高辛抗体，并改造成应用前景较好的双体抗体，可能为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体。
- 陈宇萍张国民乔媛媛赵晓航王琰
- 关键词：噬菌体抗体库地高辛
