张雨生
- 作品数：14 被引量：31H指数：4
- 供职机构：第二军医大学附属长海医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市卫生系统百名跨世纪优秀学科带头人培养计划博士后科研启动基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- D-氨基酸氧化酶基因在K562细胞中的表达及其介导的细胞毒性作用的研究被引量：4
- 2001年
- 目的 探讨逆转录病毒介导的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在K5 6 2细胞中的表达及其功能。方法 将DAAOcDNA克隆至逆转录病毒载体pLSN中 ,构建了载体pLDAAOSN ,经ΦNXA细胞包装后 ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,以重组逆转录病毒感染K5 6 2白血病细胞 ,G418筛选出抗性克隆 ,命名为KDAAO 。PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达 ,并以不同浓度的D 丙氨酸 (D Ala)处理KDAAO 细胞。结果 重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因。包装细胞产生了高滴度病毒 (5 .2× 10 6cfu ml)。DAAO基因已整合至KDAAO细胞基因组中 ,并在mRNA水平表达。D Ala能明显杀伤KDAAO 细胞。结论 DAAO D Ala自杀基因系统可以进一步用于肿瘤的基因治疗研究。
- 翟勇平王健民周虹张雨生
- 关键词：逆转录病毒载体细胞株K562细胞细胞毒性作用基因治疗
- DAAO和YCD新型自杀基因pMSCV-puro载体的构建和应用
- ＜正＞ 目的基因治疗若要走向临床,务必要建立简便、高效、快速的转基因技术平台,最终获得规模量的转基因细胞,其中载体是关键。目的:构建新型自杀基因D-氨基酸氧化酶（DAAO）和酿酒酵母胞嘧啶脱氨酶基因（YCD）的pMSCV...
- 王健民江千里温丽敏宋献民张雨生杨建民杨建民
- 文献传递
- D-氨基酸氧化酶/D-丙氨酸系统杀伤K562e细胞的作用机制探讨被引量：7
- 2002年
- 目的 :探讨 D-氨基酸氧化酶 (DAAO) / D-丙氨酸 (D - Ala)系统用作自杀基因治疗白血病的作用机制。方法 :以 D- Ala杀伤稳定表达 DAAO和绿荧光蛋白 (GFP)的高致瘤性 K 5 6 2 e单克隆细胞 KDf Gd、KDf GC,应用 MTT法检测细胞存活率 ,并用酚红氧化法测定培养上清 H2 O2 和 L owry法测定细胞蛋白数量 ,流式细胞仪测定细胞 GFP的荧光强度。结果 :在 2 5 m mol/ L D-Ala作用下 2 4 h即可完全杀死 KDf Gd细胞 ,当 D- Ala为 2 0 mmol/ L 时延长作用时间至 4 8h,杀伤率由 6 4 %增加至 96 .8% ,而D- Ala≤ 15 mm ol/ L 时杀伤率增加不明显。低于 2 0 m mol/ L,D- Ala对 K5 6 2 e几乎无杀伤作用。培养上清的 H2 O2 变化与杀伤转基因细胞作用相一致。 结论 :DAAO/ D- Ala系统可能是通过产生 H2 O2 发挥杀伤转基因 K5 6 2
- 翟勇平王健民张雨生吕书晴
- 关键词：D-氨基酸氧化酶过氧化氢白血病
- YCD基因修饰对小鼠P388白血病的体内治疗作用研究被引量：3
- 2003年
- 目的 :以P388/DBA小鼠白血病模型 ,探讨新型自杀基因YCD的体内治疗作用。方法 :用逆转录病毒载体将YCD基因导入 ,筛选P388 YCD eGFP细胞克隆 ,以P388 eGFP和野生性 (wt)P388细胞为对照。 (1) 3组细胞腹腔接种给DBA小鼠 (n =5 ) ,5× 10 6/只 (下同 ) ,观察致病性 ;(2 ) 3组细胞腹腔接种给DBA小鼠 (n =5 ) ,分别以 5 FC治疗 2周 ,观察疗效 ;(3) 2组× 5只小鼠腹腔接种P388 YCD eGFP ,5 FC 5 μmol/L·d-1× 2d或PBS治疗 ,根据小鼠存活时间推算杀伤效率。以流式细胞仪、冰冻切片和HE切片检测各脏器中白血病细胞的分布和变化。结果 :基因导入对细胞的生物学特性影响不显著 ;5 FC治疗 2周 ,YCD组小鼠存活 (17.8± 1.89)d ,而eGFP组和wtP388组分别存活 (7.8± 1.10 )d和 (7.7± 1.15 )d (P <0 0 5 ) ;5 FC治疗 2d的杀伤率达 99.6 %。结论 :YCD转基因细胞在体内可被 5 FC有效杀灭 ,该系统具有应用前景。
- 江千里王健民温丽敏张雨生江汕胡晓霞周虹
- 关键词：修饰小鼠P388白血病
- DAAO/D-Ala系统对高致瘤性K562e细胞体外杀伤效应及其机制的研究被引量：8
- 2002年
- 目的 研究D 氨基酸氧化酶 (DAAO) /D 丙氨酸 (D Ala)自杀基因系统在基因治疗中的应用。方法 应用逆转录病毒转染技术获得稳定表达DAAO的高致瘤性K5 6 2e单克隆细胞KDfGC,用PCR、原位杂交技术对DAAO基因修饰的KDfGC细胞进行鉴定 ;通过细胞形态、活细胞计数观察细胞生物学特性 ;应用MTT法检测D Ala对KDfGC、不同比例DAAO表达阳性与阴性混合细胞的杀伤作用 ;用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 水平。结果 PCR和原位杂交分析证明DAAO基因已整合至细胞基因组中 ,并在mRNA水平表达。KDfGC与未转基因的原肿瘤细胞相比 ,生长速度差异无显著性。 12 .5mmol/LD Ala作用 2 4h即可杀死近 90 %的KDfGC细胞 ,而且D Ala达到一定有效浓度杀伤效率可成倍提高。上清的H2 O2 产生水平与杀伤转基因细胞作用相一致。KDfGC与不同比例的K5 6 2e细胞混合时 ,被 15 .0mmol/LD Ala杀死的细胞比例不超过KDfGC细胞的比例。结论 DAAO/D Ala系统可有效杀伤K6 5 2e白血病细胞 。
- 王健民翟勇平张雨生周虹韩凤来
- 关键词：基因表达K562细胞系杀伤效应
- 丁胱亚磺酰亚胺增强DAAO/D-Ala系统杀伤K562e细胞作用的研究被引量：1
- 2002年
- 目的:研究了丁胱亚磺酰亚胺(BSO)增强D-氨基酸氧化酶(DAAO)/D-丙氨酸(D-Ala)自杀基因系统在白血病基因治疗中的作用。方法:应用逆转录病毒转染技术获得稳定表达DAAO的高致瘤性K562e单克隆细胞K_(DIGC),用PCR、原位杂交对DAAO基因修饰的K_(DfGC)进行鉴定。应用MTT法检测D-Ala对BSO预处理过的K_(DfGC)细胞的杀伤作用。结果:PCR和原位杂交分析证明DAAO基因已整合至细胞基因组中,并在mRNA水平上表达。D-Ala作用24h,K_(DfGC)细胞的半数抑制浓度(C_(50))为10.21mmol/L,K_(DfGC)+BSO的IC_(50)为7.92mmol/L,两者的95％可信区间不重叠。结论:BSO可增强DAAO/D-Ala系统杀伤K652e细胞作用。
- 翟勇平王健民张雨生吕书晴
- 关键词：丁胱亚磺酰亚胺白血病细胞D-氨基酸氧化酶白血病
- D-Ala对转染DAAO基因的K562e细胞移植瘤的杀伤效应被引量：2
- 2002年
- 以高致瘤性K5 6 2e细胞和表达DAAO基因的KDfGC细胞建立裸鼠移植瘤模型 ,D 丙氨酸 (D Ala)腹腔注射 ,持续 3周 ,观察D Ala对移植瘤的治疗作用以及肿瘤、裸鼠重要脏器的病理变化。结果显示 ,经D Ala治疗 ,转基因肿瘤抑制率为 5 3 8% ,未转基因肿瘤抑制率为 0 3%。治疗组KDfGC细胞瘤体出现围绕血管分布的坏死。心、肝、肾治疗组与对照组均无明显病理改变。说明在体内DAAO+的K5 6 2e能被D Ala有效杀伤 。
- 翟勇平王健民吕书晴张雨生
- 关键词：移植瘤动物实验
- D-氨基酸氧化酶基因重组逆转录病毒载体的构建及表达被引量：1
- 2001年
- 目的 :构建含D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因的重组逆转录病毒载体 ,初步观察DAAO基因的功能。方法 :利用重组DNA技术将DAAOcDNA亚克隆至逆转录病毒载体 (pLDAAOSN)中 ,以磷酸钙沉淀法介导转染包装细胞ΦXNA ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,将重组逆转录病毒感染K5 6 2白血病细胞 ,G418筛选出抗性克隆 ,命名为KDAAO。PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达 ,观察 5 0mm/LD 丙氨酸对KDAAO杀伤作用。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证明重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因。包装细胞产生了高滴度病毒 (5 .2× 10 6CFU/ml)。PCR、原位杂交分析证明DAAO基因已整合至KDAAO基因组中 ,并在mRNA水平表达。初步观察到D 丙氨酸能明显杀伤KDAAO。结论
- 翟勇平王健民周虹张雨生
- 关键词：逆转录病毒载体白血病细胞系D-氨基酸氧化酶
- 酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶基因治疗系统对K562B细胞杀伤效应的初步研究被引量：1
- 2002年
- 目的 :克隆酵母菌胞嘧啶脱氨酶 (YCD)基因 ,观察 YCD/ 5氟胞嘧啶 (YCD/ 5 - FC)系统对转基因肿瘤细胞的杀伤效应。 方法 :扩增 YCD基因并构建 YCD基因重组逆转录病毒载体 ;载体转染包装细胞获得高滴度病毒并转染高致瘤细胞K5 6 2 B,筛选并鉴定阳性转基因克隆 ;以 MTT法检测 5 - FC对 YCD转基因细胞的杀伤效应 ,测定转基因细胞裂解产物对5 - FC→ 5 - FU的转化。结果 :PCR法扩增出全长 YCD基因 ,经测序证实序列正确 ;构建了 MSCV - YCD- IRES- EGFP逆转录病毒载体 ,载体转染包装细胞Ф NX- A,获得滴度为 3.5× 10 6 CFU / m l的逆转录病毒 ;病毒转染 K5 6 2 B,转染率为 30 % ,经筛选获得转基因阳性克隆 YCD- K 5 6 2 B,RT- PCR检测显示 YCD- K5 6 2 B有 YCD基因的 m RNA表达 ,其细胞裂解产物可使 5 - FC转化为 5 - FU,表明其有 CD酶活性 ;MTT法检测低浓度 5 - FC(15μmol/ L )作用 96 h对 YCD- K5 6 2 B有明显的杀伤效应。 结论 :YCD/ 5 - FC系统对转基因肿瘤细胞有明显的杀伤效应。
- 张雨生王健民翟勇平
- 关键词：5-氟胞嘧啶杀伤效应逆转录病毒载体基因治疗
- YCD/5-FC自杀基因治疗系统对K562B白血病细胞杀伤作用的小鼠体内实验研究被引量：6
- 2002年
- 目的 了解酵母菌胞嘧啶脱氨酶 5 氟胞嘧啶 (YCD 5 FC)系统在体内对转基因高致瘤性K5 6 2细胞 (K5 6 2B细胞 )的杀伤效应。方法 以高滴度逆转录病毒转染K5 6 2B细胞并筛选出阳性转染克隆YCD K5 6 2B ;12只SCID小鼠分为治疗及对照组 ,在小鼠左右两侧近前肢处腹部皮下注射YCD K5 6 2B及K5 6 2B细胞 ,成瘤后治疗组腹腔注射 5 0 0mg kg 5 FC共 10d ,对照组腹腔注射生理盐水 ,观察瘤体相对体积变化及病理变化。结果 瘤细胞接种第 2 1天 ,瘤体相对体积分别为 :YCD K5 6 2B +5 FC组 2 .92 2± 0 .5 81,YCD K5 6 2B +生理盐水组 2 4.434± 4.790 ,K5 6 2B +5 FC组 2 2 .70 1± 2 35 0 ,K5 6 2B +生理盐水组 2 4.46 0± 1.6 70 ;YCD K5 6 2B +5 FC组与YCD K5 6 2B +生理盐水组相比差异非常显著 (P =0 0 0 0 1) ,K5 6 2B +5 FC组及K5 6 2B +生理盐水组相比 ,差异无显著性 (P =0 .0 96 ) ,表明 5 FC对转YCD基因的K5 6 2B白血病细胞有明显的杀伤效应 ,而对未转基因细胞的生长无影响 ;YCD K5 6 2B +5 FC组瘤体于瘤细胞接种后第 12～第 15天 (5 FC治疗的第 3～第 6天 )有所缩小 (最小的相对体积为 0 .6 81) ,病理检查可见 5 FC治疗组瘤体有以小动脉血管为中心的坏死。结论 YCD 5
- 张雨生王健民周虹翟勇平
- 关键词：白血病细胞杀伤作用5-氟胞嘧啶K562细胞株白血病
