李风知
- 作品数：14 被引量：19H指数：2
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中高效表达研究被引量：3
- 1993年
- 通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CHO细胞内高效表达了人尿激酶原(Pro-UK)cDNA。首先将pro-UK cDNA插入到SRα启动子的下游,构建成表达质粒pMG10102,在COS-7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2-dhfr线性化后用磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr^-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro-UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12.5—100IU/10~6 cells/d.再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500IU/10~6 cells/d。经2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro-UK具有与天然pro-UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60%以上)。
- 程度胜俞炜源韩素文李秀珍李风知胡宝成方继明黄翠芬
- 关键词：尿激酶原CDNA基因工程
- 重组人糖基化尿激酶原的制备方法
- 本发明是利用生物工程的方法，通过基因工程技术构建了一种有双重放大功能的表达载体，并获得一株高效表达的CHO工程细胞。经微载体和低血清培基高密度灌流培养和纯化，制备一种治疗冠状动脉梗塞，脑血栓，中央视网膜动静脉血栓和其他血...
- 方继明肖成祖余炜源张正光李风知黄子才陈昭烈叶建新
- 文献传递
- pXMT-uk和pMTSV-duk中尿激酶原基因在cos-7细胞中表达水平的比较
- pXMT-UR是一个含有小鼠金属硫蛋白 (MT)基因启动子调控着尿激酶原基因的细菌动物细胞穿梭表达载体;在这一载体的基础上,
- 李风知
- 文献传递
- 外源基因在哺乳动物细胞中的表达产物抗原性和生物活性的不一致现象
- 在用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达尿激酶原的研究中,当对不同的转化克隆细胞灶用 ELISA法和纤维平板溶圈法分别测定表达产物抗原性和生物活性时,我们发现某些有较强
- 李风知林建波李军
- 文献传递
- 尿激酶B链cDNA及其与水蛭素12肽cDNA融合基因的构建
- 1994年
- 尿激酶原是一种溶栓效果好、副作用小的溶栓药物。研究证明尿激酶B链,即低分子量单链尿激酶,具有与尿激酶原相同的溶栓特性,对血栓溶解具有特异性,引起系统性出血的副作用较小,有可能成为一种较为理想的溶栓药物。它的氨基酸序列相当于尿激酶原的144～411aa,国外已通过缺失突变获得了它的结构基因,并在中国仓鼠卵巢细胞中表达成功。由于尿激酶B链分子量较小,且含尿激酶原的酶活功能区,
- 李秀珍刘凤云李风知程度胜
- 关键词：尿激酶原融合基因水蛭素溶栓效果
- 重组人糖基化尿激酶原的制备方法
- 本发明是利用生物工程的方法,通过基因工程技 术构建了一种有双重放大功能的表达载体,并获得一株高效表 达的CHO工程细胞。经微载体和低血清培基高密度灌流培养 和纯化,制备一种治疗冠状动脉梗塞,脑血栓,中央视网膜动静脉 血栓...
- 方继明肖成祖余炜源张正光李风知黄子才陈昭烈叶建新
- 文献传递
- 水蛭素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达被引量：1
- 1998年
- 目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列。通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因。结果：构建了水蛭素１２肽与低分子量尿激酶的融合基因，在大肠杆菌中获得表达。重组融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。结论：运用ＤＮＡ重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗凝活性。
- 刘凤云李秀珍李风知程度胜
- 关键词：抗凝血酶融合基因
- 用国产SH－2型微载体和低血清培基灌流培养CHO工程细胞被引量：2
- 1995年
- 采用国产ＳＨ—２型聚苯乙烯微载体和新研制的低血清培基添加剂ＢＩＧＢＥＦ—２，在改进了的灌流控制系统的控制下灌流培养产尿激酶原ＣＨＯ工程细胞ＣＬ—１１Ｇ，所得细胞密度超过１×１０￣７细胞／ｍｌ，尿激酶原平均活性为４００７ＩＵ／ｍｌ，最高达６６１４ＩＵ／ｍｌ，均高于以前采用５％血清的培基和Ｂｉｏｓｉｌｏｎ微载体培养时的水平，从而更有利于中试和未来的大规模工业化生产。
- 肖成祖黄子才陈昭烈郭智霞高丽华李风知周鹤山李予川
- 关键词：微载体添加剂尿激酶原
- 人尿激酶原在CHO细胞中的基因扩增与高效表达被引量：1
- 1993年
- 本文通过基因共转染和基因共扩增方法,在SV40病毒晚期启动子控制下成功地在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-DHFR^-)中高效表达了人尿激酶原,其表达水平在5×10^(-6) mol/L氨甲喋呤存在下可达2—3μg/10~6细胞/24 h。采用PMA诱导可将表达水平提高至3.5—4μg/10~6细胞/24 h。相应的Pro-UKcDNA在细胞基因组上整合的拷贝数为200—300拷贝/细胞。Western blot分析表明,表达出来的重组Pro-UK与天然Pro-UK具有相似的分子量:S_(2444)测活法证明重组Pro-UK具有体外酰胺水解活性。
- 张宏权李风知俞炜源李秀珍方继明费恩阁黄翠芬
- 关键词：尿激酶原CHO细胞基因扩增
- 人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达被引量：12
- 1991年
- 通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV_2-proUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV_2-dhfr或MMTV-dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氢叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr^+)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为241U/10~6细胞/48h,16IU/10~6细胞/48h。用ELISA测定CLF-14和CLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P/N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0.14—0.22μg/10~6细胞/48h和0.08—0.14μg/10~6细胞/48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。
- 李风知李秀珍唐宏娣张宏权胡宝成韩素文俞炜源方继明黄翠芬
- 关键词：基因表达
